JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:34 min • July 8th, 2025
Para la transfección inversa de ARN interferente pequeño, o ARNip, una clase de ARN bicatenario, en adipocitos o células grasas no adherentes, prepare una suspensión de ARNip dirigidos a un gen codificador de proteínas específico en los adipocitos. Agregue un reactivo de transfección adecuado a base de lípidos catiónicos. Incubar la mezcla para formar complejos de transfección a través de interacciones electrostáticas.
Transfiera la mezcla a pocillos recubiertos de colágeno de una placa de pocillos múltiples. Los complejos de transfección se inmovilizan en el recubrimiento de la placa por interacciones no específicas. Pipetee una suspensión de adipocitos en pocillos que contienen complejos de transfección inmovilizados. Los adipocitos se adhieren libremente al recubrimiento de la placa, aumentando el contacto físico entre las células y los complejos.
El complejo de transfección se fusiona con la membrana celular y entrega el ARNip al citoplasma. El ARNip, que comprende una hebra antisentido con una secuencia complementaria para dirigirse al ARNm y una hebra de sentido, es reconocido por el complejo silenciador inductor de ARN multiproteico, o RISC. El ARNip se une al RISC y las hebras se separan, y la hebra antisentido permanece unida al complejo.
El complejo siRNA-RISC activado reconoce y se une a los sitios complementarios en el ARNm diana. Esto conduce a la escisión específica de la secuencia del ARNm por parte de la proteína argonauta del complejo RISC. El ARNm escindido es degradado aún más por la maquinaria celular, silenciando así la expresión del gen diana.
Pipetee el ARNip con un medio esencial mínimo mejorado para mezclar e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Agregue el reactivo de transfección y el medio esencial mínimo mejorado al ARNip y pipetee para mezclar. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue la mezcla de transfección a cada pocillo de la placa recubierta de colágeno.
Lave las células en la placa de Petri de 100 milímetros dos veces con DPBS. Agregue tripsina 5X a las células, asegurándose de cubrir toda la superficie con tripsina. Espere 30 segundos y retire con cuidado la tripsina. Incubar la placa de Petri durante 5 a 10 minutos a 37 °C en la incubadora.
Luego, golpee el plato para separar las células, evitando daños celulares. Agregue 10 mililitros de DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de FCS y 1% de penicilina y estreptomicina, para neutralizar la tripsina. Pipetear con cuidado el medio hacia arriba y hacia abajo para separar las células y homogeneizar la suspensión celular.
Cuente las células utilizando una cámara de recuento Malassez o un contador de células automatizado y ajuste la concentración de las células a 6,25 x 105 células/ml de medio. Siembre 800 microlitros de la suspensión celular por pocillo de una placa de 12 pocillos, o 400 microlitros de la suspensión celular por pocillo de una placa de 24 pocillos que contiene la mezcla de transfección.
Incube las placas en una incubadora de cultivo celular y no las moleste durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con DMEM fresco sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de FCS y 1% de penicilina y estreptomicina, y devuelva las células a la incubadora.