Sistema regulable Tet-off inducible: un método in vitro para modular la expresión génica en células cultivadas mediante el sistema Tetraciclina-Off

Comience tomando una suspensión de células receptoras cultivadas en un tubo. Complemente el tubo con plásmidos inducibles que contengan el gen de interés. La expresión de este gen está bajo el control de una secuencia promotora aguas arriba fusionada con un operador de tetraciclina o TetO, formando un elemento sensible a la tetraciclina o TRE.

Además, agregue vectores reguladores de tetraciclina, cada uno de los cuales contiene un gen que codifica la proteína transactivadora de tetraciclina recombinante o tTA. Electroporar la mezcla de ADN celular para usar pulsos eléctricos para facilitar la absorción de plásmidos por parte de la célula.

Después de la electroporación, coloque las células en placas e incube durante el tiempo deseado. Al entrar en el núcleo, el vector de tetraciclina expresa la proteína tTA. El tTA es una proteína híbrida que contiene un represor de Tet o la fracción TetR y un dominio transactivador de transcripción viral VP16.

La fracción TetR se une a la secuencia TetO del elemento TRE, mientras que el dominio VP16 permite que la ARN polimerasa sintetice el ARNm del ADN aguas abajo, lo que finalmente conduce a la expresión génica. Reemplace los medios de crecimien