Edición de genes mediada por morfolinos: una técnica de eliminación de genes que utiliza oligonucleótidos de morfolino bloqueantes traslacionales en huevos unicelulares de peces de cueva

Los morfolinos son oligonucleótidos rediseñados cortos, monocatenarios, con diferencias en su columna vertebral de fosfato y estructura de azúcar en comparación con los nucleótidos naturales. Estas características mejoran la estabilidad de los morfolinos en el pH fisiológico. A pesar de estas variaciones, los morfolinos contienen las nucleobases estándar, que ayudan a diseñar oligonucleótidos complementarios a la secuencia específica de ARNm de un gen diana deseado para ser eliminado.

Para realizar la edición de genes impulsada por morfolino, comience tomando huevos unicelulares de peces de las cavernas colocados dentro de los pocillos de una placa de inyección de agarosa. Visualice los huevos translúcidos y redondos para ubicar el saco vitelino, una estructura llena de líquido presente dentro del huevo.

Tome una aguja de microinyección precargada con una solución que contenga morfolinos diseñados. Inyecte la solución directamente en la yema de huevo, asegurándose de que los morfolinos entren en el citoplasma celular. Dentro de las células, el gen diana forma el ARNm, que se transporta al citoplasma.

Dentro del citoplasma, la morfolino inyectada se hibrida con su transcripción de ARNm diana complementaria en el sitio de iniciación endógeno y se extiende más allá de él. Este proceso bloquea la unión de la subunidad más grande del ribosoma con el complejo de iniciación de traducción naciente que consiste en una pequeña subunidad ribosómica complejada con algunas proteínas específicas.

Posteriormente, la progresión del complejo de inicio de la traducción se ve obstaculizada estéricamente, lo que detiene la traducción del ARNm a la proteína. Finalmente, la concentración de proteína diana se reduce debido al bloqueo de la traducción por morfolinos.

El día de la inyección, use una pipeta de vidrio para transferir huevos unicelulares a la placa de inyección, llenando hasta cinco filas de la placa de inyección con 30 a 40 huevos por fila. Mantenga los huevos hidratados con una pequeña cantidad de agua del sistema de peces. Descongele la morfolino en hielo y prepare la solución de inyección de modo que se inyecten 400 picogramos de morfolino por huevo, utilizando una punta de pipeta Microloader larga o añadiendo un bolo de 2 a 4 microlitros al final.

Cuando se hayan cargado todas las agujas, use fórceps para recortar el exceso de longitud de las puntas de las agujas de inyección y monte la primera aguja en un micromanipulador conectado a un microinyector de picolitros. Luego, coloque la placa de inyección bajo un microscopio de disección y use el micromanipulador para penetrar cada huevo con la aguja, antes de inyectar 1 nanolitro de solución de inyección de morfolino directamente en la yema.