Transgénesis del pez cebra mediada por transposones Tol2: un procedimiento para generar peces cebra transgénicos tras la coinyección del sistema Tol2 en embriones fertilizados de pez cebra

Comience con embriones viables de pez cebra en etapa unicelular colocados en los pocillos de un molde de microinyección.

Cargue una aguja de microinyección con una solución que contenga ARNm que codifica la transposasa Tol2 y plásmidos donantes de transposones. Los plásmidos comprenden un promotor ubicuo del pez cebra y un gen fluorescente que codifica proteínas flanqueado por brazos transposones Tol2.

Inyecte con cuidado la solución de microinyección en el citoplasma del embrión de pez cebra. Dentro de la célula, los ARNm de transposasa Tol2 se traducen en proteínas transposasa Tol2 y se transportan activamente al núcleo.

Los sitios Tol2 en el plásmido donante comprenden repeticiones terminales invertidas específicas, o ITR, que flanquean el gen informador. Los RTI están flanqueados por repeticiones cortas y directas. Las proteínas transposasa reconocen y se unen a los sitios ITR, formando una horquilla en el ADN flanqueante. Las transposasas escinden aún más la construcción del transposón del ADN flanqueante, liberándolo del plásmido y dejando repeticiones cortas y directas.

Las transposasas crean una ruptura escalonada de doble hebra en el genoma de la célula somática e insertan la construcción del transposón en el sitio del genoma. El relleno de los extremos escalonados por la ADN polimerasa seguido de la ligadura de las muescas crea repeticiones cortas y directas.

La ligadura provoca una integración estable de la construcción de transposones en el genoma de la célula somática y el promotor facilita la expresión de proteínas fluorescentes. Incubar los embriones inyectados. Durante el desarrollo embrionario, las células somáticas dan lugar a diferentes tipos de células y crean peces cebra transgénicos.

Después de preparar el ARNm de transposasa Tol2 y la solución inyectable, de acuerdo con el protocolo de texto, la tarde antes de la inyección, configure de cuatro a seis tanques de cría con al menos dos machos y dos hembras. Para reducir la cantidad de desechos de peces e inducir una respuesta de reproducción, evite alimentar a los peces por la tarde.

A la mañana siguiente, retire la solución de inyección preparada del congelador a 80 grados centígrados negativos y colóquela en hielo. Tire de los divisores en los tanques de cría de peces y permita que los peces se apareen. En general, los peces ponen huevos en 20 a 30 minutos.

Mientras espera, usando un extractor de micropipetas con los siguientes parámetros, extraiga las agujas del vidrio capilar. Use una toallita de laboratorio para romper el extremo de la aguja y crear un borde biselado. Se prefiere un diámetro más pequeño para disminuir la mortalidad embrionaria.

Una vez que los peces hayan puesto huevos, recójalos en una placa de Petri de 10 centímetros de diámetro. Inmediatamente bajo el microscopio de disección, retire todos los embriones anormales y los desechos de peces. Luego, pipetee los embriones fertilizados en un molde de inyección de agarosa al 3% preparado. Elimine el exceso de agua para ayudar a mantener los embriones en su lugar.

Una vez que todas las filas estén llenas de embriones viables, colóquelas de modo que las células individuales estén orientadas en un ángulo de 45 grados horizontalmente con respecto a la aguja. Esto hará que la inyección sea mucho más fácil más adelante. A continuación, mientras usa guantes, use una punta de pipeta de carga de 20 microlitros para eliminar 5 microlitros de la construcción preparada del tubo en hielo.

Inserte con cuidado la punta de la pipeta en el extremo posterior del tubo capilar roto hasta donde comienza a estrecharse, para que el reactivo se acerque lo más posible a la punta y expúltelo al capilar. Si todavía hay burbujas de aire, agite la aguja, asegurándose de no romper la punta.

Inserte la aguja directamente en el portaagujas de microinyección y apriete con cuidado hasta que la aguja permanezca en su lugar, luego, ajuste el ángulo a aproximadamente 45 grados. Una vez que la aguja esté preparada y conectada, encienda el microscopio y el tanque de presión de gas. Ajuste el volumen de inyección usando aproximadamente 0.5 PSI para mantener y 30 PSI para expulsar.

Compruebe que la solución se expulsa de la aguja al pisar el pedal. Usando un micrómetro de platina con una gota de aceite mineral, ajuste el volumen y el flujo de la solución a aproximadamente 10 micrómetros de diámetro. Asegúrese de que la contrapresión permita que gotee una pequeña cantidad de solución de la aguja.

Si no hay suficiente contrapresión, la acción capilar hará que entre líquido en la aguja y destruya el ARNm. Una vez calibrada la aguja, inserte la aguja en la célula única de los embriones fertilizados utilizando el borde de la muesca de gel para proporcionar un respaldo que mantenga al embrión en su lugar y permita que la aguja aplique presión sin mover el embrión.

Una vez que la punta de la aguja esté en la celda única, presione el pedal para liberar la cantidad deseada de solución. Es importante inyectar la solución en la célula, no en la yema para generar pez cebra transgénico. Repita este proceso para todos los embriones.

Cuando termine, use una pipeta de transferencia desechable de 3.4 mililitros y agua del sistema de peces para transferir los embriones inyectados a un plato etiquetado enjuagándolos de la muesca de agarosa. Guarde los embriones en una incubadora de 28,5 grados centígrados para que se desarrollen.