Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:29 min. • July 8th, 2025
Comience con una suspensión de células madre pluripotentes inducidas por humanos, hiPSC, en un tampón de electroporación adecuado. Agregue una solución que consista en plásmidos que codifican la transposasa PiggyBac y plásmidos donantes. Electroporar la mezcla.
Los pulsos eléctricos permeabilizan transitoriamente las membranas celulares, facilitando la captación celular de plásmidos. Los plásmidos donantes comprenden repeticiones terminales invertidas específicas de transposones, ITR, que son complementos invertidos entre sí, flanqueados por repeticiones TTAA que ponen entre paréntesis la proteína diana y los genes de resistencia a los antibióticos.
Las proteínas transposasa PiggyBac expresadas crean muescas en los extremos 3' de los ITR, internos a las repeticiones TTAA. Los grupos 3'-hidroxilo expuestos atacan el nucleótido de la hebra complementaria dentro del ADN flanqueante, formando horquillas TTAA en los extremos de los transposones, liberando así la construcción de transposones del plásmido.
Las transposasas resuelven las horquillas para formar voladizos TTAA en los extremos 5' de la construcción del transposón. Las transposasas crean además roturas de doble hebra en la sec
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