Knockout de múltiples genes mediado por concatemeros CRISPR: una técnica para eliminar simultáneamente múltiples genes mediante una vía de unión de extremos no homóloga en células intestinales de ratón

Para eliminar simultáneamente múltiples genes utilizando el sistema CRISPR-concatemer-Cas9, comience con un tubo que contenga la suspensión de células intestinales del ratón. Complemente el tubo con vectores concatemeros CRISPR que contengan el casete de expresión para múltiples ARN guía, o ARNg, integrados adyacentes entre sí.

Cada casete de ARNg está diseñado a medida para eliminar individualmente el gen deseado. Agregue vectores de expresión que codifican la endonucleasa Cas9 al mismo tubo. Electroporar la mezcla de plásmidos celulares: una técnica que utiliza corriente eléctrica para facilitar la entrada de plásmidos en la célula. Dentro de la célula, la coexpresión del concatemer CRISPR y el vector Cas9 forma secuencias de ARNg y nucleasas Cas9, respectivamente.

Cada secuencia de ARNg se une a la enzima Cas9 correspondiente, formando múltiples complejos Cas9-ARNg que se unen a los sitios objetivo en el genoma del huésped. Esta unión activa la enzima Cas9, que produce una muesca en ambas hebras de ADN aguas arriba del sitio del motivo adyacente protoespaciador, o PAM. Esto da como resultado una ruptura de doble hebra, o DSB, en el ADN diana.

En ausencia de una secuencia homólog