Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 2:59 min. • July 8th, 2025
Para la separación por cromatografía de intercambio aniónico de una proteína de interés de un lisado de proteína bacteriana dializado, agregue un tampón de unión para reducir la viscosidad del lisado y evitar que obstruya la columna cromatográfica.
Los agentes quelantes en el tampón se unen a cationes divalente, inhibiendo la actividad de la proteasa y evitando la degradación de las proteínas. Además, el tampón con pH por encima del punto isoeléctrico de la proteína diana, pI, el pH al que la proteína no tiene carga neta, hace que el exceso de iones hidroxilo cargados negativamente neutralice los grupos amina cargados positivamente de la proteína, lo que hace que la superficie de la proteína se cargue negativamente.
Ensamble la columna de cromatografía de intercambio aniónico que contiene una fase estacionaria reticulada basada en agarosa con grupos de aminas cuaternarias cargados positivamente. Agregue el tampón de unión para preparar la columna para la máxima interacción de proteínas durante la carga de la muestra. Cargue el lisado bacteriano diluido.
Las proteínas diana cargadas negativamente se unen más estrechamente a los grupos cargados positivamente en la columna que las proteínas menos cargadas negativamente.
Ejecute el tampón de unión para eliminar las proteínas cargadas positivamente no unidas de la columna. Pase un tampón de elución a través de la columna, aumentando gradualmente la concentración de sal. A bajas concentraciones de sal, los iones negativos compiten con proteínas débilmente unidas para unirse a la columna, provocando su elución.
Posteriormente, el tampón de alta concentración de sal desplaza a las proteínas de interés estrechamente unidas con un tiempo de retención más largo, eluyendo las proteínas diana. Las proteínas diana recogidas pueden utilizarse para un análisis posterior.
Inicie el FPLC con el mantenimiento general. Conecte los tampones de columna AIEX-A y AIEX-B a las válvulas de amortiguación, y la columna que contiene resina de intercambio aniónico a los puertos de columna del FPLC. Ajuste los parámetros cromatográficos generales en consecuencia.
Inicie el programa AIEX en el software FPLC y elija el volumen de equilibrio para el tampón A. Posteriormente, cargue la muestra en la columna y eluya las proteínas con un gradiente lineal de 0% a 100% de tampón con alto contenido de sal. Recolecte fracciones de 2 mililitros durante la elución.
Analice las fracciones eluidas después de terminar la ejecución.