Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:22 min. • July 8th, 2025
La cromatografía de interacción hidrofóbica dependiente de calcio es una técnica para separar las proteínas de unión al calcio de otras proteínas no unidas al calcio en una muestra.
Para comenzar, tome una columna de cromatografía preensamblada que contenga una matriz de perlas de agarosa reticuladas derivadas con grupos fenilo hidrofóbicos para facilitar las interacciones con las proteínas objetivo. Equilibrarlo con un tampón de unión que contenga una concentración muy alta de iones de calcio para una máxima interacción entre la resina y la proteína diana durante la carga posterior de la muestra.
Tome una muestra que contenga la mezcla de proteínas dializadas y complétela con una concentración igual de cloruro de calcio que la utilizada en el tampón de unión para el equilibrio de la columna. Esto maximiza la unión de proteínas a la columna.
Los iones de calcio se unen a proteínas específicas en el lisado, induciendo un cambio conformacional en estas moléculas de proteínas exponiendo sus regiones hidrofóbicas.
Filtrar la mezcla para separar las impurezas y los agregados para evitar que obstruyan la columna. Cargue este filtrado en la columna preequilibrada. Las proteínas con regiones hidrofóbicas expuestas interactúan con los correspondientes grupos fenilo hidrófobos de la resina.
Lave con el tampón aglutinante que contiene sal para eliminar las proteínas no unidas y mejorar la pureza de la muestra en pasos posteriores. Pase el tampón de elución sin cloruro de calcio que contiene EDTA, un quelante divalente, a través de la columna.
A medida que el EDTA quela los iones de calcio, se interrumpen las interacciones hidrofóbicas entre la proteína diana y la resina. Las proteínas diana se vuelven móviles y eluyen de la columna.
Para continuar con la purificación de proteínas, después de la diálisis de proteínas, agregue cloruro de calcio a la muestra hasta una concentración final de 25 milimolares, lo que facilitará la unión de S100A12 a la resina en el siguiente paso. Luego, filtre la muestra a través de un filtro con un tamaño de vertido de 0,45 micras.
Equilibre los tampones HIC y las muestras a 4 grados centígrados. A continuación, conecte los búferes de columna HIC-A y B y la columna al sistema y ajuste los parámetros.
Inicie el método para equilibrar la columna con volúmenes de 1 a 2 columnas de tampón HIC-A y cargue la muestra y el 'bloque de muestra sin ligar de lavado' cuando la señal UV alcance nuevamente el nivel de referencia.
A continuación, comience la elución con un tampón EDTA que contenga quelante de calcio. Recoger 2 mililitros de fracciones máximas durante la elución.