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La pared celular de las micobacterias contiene diferentes variantes de ácidos micólicos: ácidos grasos de cadena larga con cadenas alfa conservadas. Existen diferencias estructurales en sus cadenas beta, lo que da lugar a variaciones en la polaridad de diferentes ácidos micólicos.
Para separar las variantes mediante cromatografía en capa fina, o TLC, una técnica de cromatografía líquida, tome los lípidos de la pared celular de las micobacterias en el disolvente orgánico deseado. Detecte los lípidos cerca de la base de una placa TLC prerecubierta con una capa delgada de material adsorbente, que funciona como fase estacionaria.
Coloque la placa dentro de un frasco que contenga un solvente orgánico, la fase móvil, asegurándose de que el nivel de líquido esté por debajo de los puntos de muestra para evitar la difusión prematura de los ácidos micólicos.
Durante la ejecución, la fase móvil se eleva a través de los pequeños poros de la capa adsorbente en la placa a través de la acción capilar. Finalmente, los ácidos micólicos se disuelven en el solvente y viajan hacia arriba.
La fase estacionaria polar adsorbe transitoriamente variantes más polares de ácido micólico a través de fuerzas intermoleculares, lo que dificulta su movimiento ascendente. Los ácidos micólicos menos polares permanecen en la fase móvil no polar y migran más.
Las diferencias en la migración dan como resultado que las variantes del ácido micólico se separen en bandas discretas.
Al finalizar, rocíe la placa seca con una mancha de ácido fosfomolíbdico. Caliente la placa para reducir la mancha en presencia de lípidos, impartiendo un color verde oscuro a las bandas.
Para analizar las muestras por TLC, cubra una pared de la cámara de TLC con un trozo de papel de filtro. Agregue vaselina en las esquinas de la cámara para sellar la cámara. Decanta la mezcla de disolvente sobre el papel de filtro y añade el volumen restante del disolvente al fondo de la cámara de TLC. Cierre la cámara TLC durante al menos 20 minutos para saturarla
Mientras tanto, disuelva los lípidos en el tubo de vidrio en 200 a 1,000 microlitros de cloroformo y use un tubo de vidrio capilar para aplicar 10 microlitros de la suspensión de lípido y cloroformo directamente sobre la placa TLC. Después de dejar que la muestra se seque durante cinco minutos, inserte la placa en la cámara de TLC saturada y deje que la fase móvil pase a través de la TLC.
Cuando el disolvente alcance 1 centímetro del extremo superior de la placa, colóquela bajo fundente laminar hasta que la sílice esté completamente seca. Luego, rocíe la placa seca con 15 a 20 mililitros de hidrato de ácido molibdafosfórico al 10% en etanol, hasta que la placa esté de color amarillo brillante, y caliente la placa durante dos a cinco minutos a 120 grados centígrados.