Purificación de baculovirus basada en cromatografía de afinidad con heparina: una técnica para aislar baculovirus del sobrenadante de células de insectos

Los baculovirus, virus de ADN bicatenario, están rodeados por una envoltura que contiene las principales glicoproteínas virales, como GP64.

Para aislar baculovirus de un sobrenadante de cultivo celular que contiene desechos celulares y proteínas contaminantes, ensamble una columna de cromatografía de afinidad de heparina que contenga una matriz de perlas de agarosa reticuladas. Estas perlas están acopladas a la heparina, un polisacárido lineal con grupos sulfato, que imparten una carga negativa a la cadena de heparina.

Equilibre la columna con un tampón de lavado que tenga un pH neutro y una fuerza iónica óptima para proporcionar condiciones favorables para las interacciones máximas de baculovirus y heparina durante la carga de sobrenadante. Cargue el sobrenadante que contiene baculovirus en la columna.

Los aminoácidos básicos del baculovirus GP64 facilitan las interacciones electrostáticas inespecíficas con la heparina cargada negativamente y se unen firmemente a la columna, a diferencia de los contaminantes que se unen sin apretar. Enjuague la columna con un tampón de lavado, eliminando las proteínas contaminantes y los desechos no unidos y sueltos.

Pase un tampón de elución con mayor fuerza iónica que el tampón de lavado a través de la columna. La mayor fuerza iónica interrumpe las interacciones electrostáticas baculovirus-heparina, disociando y eluyendo los baculovirus de la columna.

Recoja el eluido que contiene baculovirus en el flujo. Diluir inmediatamente la suspensión de baculovirus con un tampón que contenga concentraciones fisiológicas de sal, evitando la inactivación del virus. Los baculovirus aislados se pueden utilizar para análisis adicionales.

Configure el sistema de cromatografía colocando la línea de tampón de lavado desde el puerto de entrada A1 en una botella que contenga al menos 500 mililitros de tampón de lavado. Utilice el puerto de entrada del búfer A2 para cargar el búfer de elución.

Inserte varios tubos cónicos de 50 mililitros en el colector de fracciones para recoger el sobrenadante de baculovirus de paso de columna, el tampón de lavado y el baculovirus eluido. Equilibre la columna de heparina con cinco volúmenes de columna de 7,9 mililitros de tampón de lavado, a un caudal lineal de 7 mililitros por minuto.

Cargue 250 mililitros de sobrenadante de baculovirus en la columna de heparina, utilizando la bomba de muestra del puerto de muestra de entrada a un caudal lineal de 2 mililitros por minuto. Luego, pase 10 volúmenes de columna de tampón de lavado a través de la columna de heparina a un caudal lineal de 2 mililitros por minuto, hasta que la curva de absorbancia ultravioleta haya vuelto a la línea de base y se haya estabilizado.

Diluya las partículas de baculovirus de la columna de heparina con cinco volúmenes de columna de tampón de elución a un caudal lineal de 4 mililitros por minuto. Esté atento a un pico de elución agudo de proteína en el cromatograma cuando las partículas de baculovirus se disocian de la columna de heparina.

Después de la elución, diluya inmediatamente el sobrenadante de baculovirus eluido 10 veces usando tampón de fosfato de sodio de 20 milimolares para evitar la inactivación de las partículas de baculovirus por choque osmótico durante la centrifugación posterior.