Cromatografía de intercambio catiónico: una técnica para aislar la proteína recombinante diana del lisado de células de insectos basada en la carga superficial neta

La cromatografía de intercambio catiónico facilita la separación de proteínas de las mezclas en función de su carga superficial neta.

Para el aislamiento de proteínas del transductor de señales diana del lisado de proteínas de células de insectos, obtenga un lisado de proteínas diana dializado que contenga otras proteínas contaminantes. Agregue tampón que contenga cloruro de sodio para reducir la viscosidad del lisado y mejorar la solubilidad de las proteínas, lo que ayuda a prevenir la obstrucción de la columna cromatográfica durante la ejecución.

Además, el pH amortiguador por debajo del punto isoeléctrico de la proteína diana, pI, en el que la proteína tiene carga neta cero, facilita la unión del exceso de iones de hidrógeno a grupos carboxilato negativos, lo que hace que la proteína diana se cargue positivamente.

Ensamble la columna cromatográfica que contiene perlas de agarosa reticuladas acopladas a grupos cargados negativamente. Agregue tampón de unión para equilibrar la columna y maximizar las interacciones columna-proteína. Cargue el lisado diluido en la columna equilibrada.

Las proteínas diana con carga más positiva interactúan y se unen estrechamente a los grupos cargados negativamente de la columna que las proteínas contaminantes con carga menos positiva.

Lave la columna con tampón para eliminar las proteínas contaminantes cargadas negativamente no unidas. Posteriormente, pase el tampón de elución, mientras aumenta gradualmente su fuerza iónica.

A baja fuerza iónica, existe una competencia mínima entre los iones positivos y las proteínas por los grupos negativos en la columna, eluyendo proteínas contaminantes débilmente unidas y menos cargadas positivamente. Sin embargo, a medida que aumenta la fuerza iónica, los iones de sal compiten con las proteínas transductoras de señales objetivo estrechamente unidas y reducen las interacciones entre las proteínas y la columna, eluyéndolas como una fracción purificada.

Prepare una columna de intercambio catiónico de 20 mililitros lavándola con tres volúmenes de columna de tampón G, luego con tres volúmenes de columna de tampón F. A continuación, diluya 20 mililitros de la muestra dializada hasta una concentración final de cloruro de sodio de 100 milimolares, agregando 20 mililitros de tampón E, y aplique la muestra a la columna de intercambio.

Es fundamental diluir la pequeña cantidad de la muestra en lugar de toda a la vez, y las muestras diluidas deben aplicarse a la columna inmediatamente después de la dilución para limitar la precipitación de la proteína.

Continúe cargando la columna con muestra recién diluida a medida que la dilución anterior se acerca al final de la carga. Luego, lave la columna a la absorbancia de referencia 280 con Buffer F, que generalmente requiere tres volúmenes de columna.

Eluya la proteína de la columna con un gradiente de 400 mililitros desde el tampón F hasta el tampón G al 65%, recogiendo el eluido en fracciones de 6 mililitros. Una vez que se complete el gradiente, continúe lavando la columna durante 1,5 volúmenes de columna adicionales de 65% de tampón G.