Separación de vesículas extracelulares bacterianas basadas en cromatografía de exclusión por tamaño: una técnica para separar poblaciones heterogéneas de vesículas de membrana externa bacterianas gramnegativas en función de su tamaño

En condiciones de cultivo adecuadas, las bacterias gramnegativas liberan vesículas de membrana externa que transportan carga, u OMV, en el sobrenadante. Estas vesículas son estructuras esféricas, pequeñas y de tamaño heterogéneo, que median la comunicación celular.

Para fraccionar subpoblaciones de OMV de diferentes tamaños, tome una columna de cromatografía de exclusión por tamaño vacía con un filtro apropiado en su base para soportar la matriz.

Empaque la columna con una matriz de filtración de gel que consiste en perlas esféricas químicamente inertes de tamaño de poro definido, lo que garantiza que el tamaño sea óptimo para excluir la entrada de OMV de gran tamaño. Equilibre la columna con un tampón adecuado para evitar que las perlas se sequen para una purificación óptima.

Cargue el sobrenadante de cultivo bacteriano que contiene subpoblaciones de diferentes tamaños de OMV, agregados de proteínas y ácidos nucleicos en la parte superior de la columna. Deje que las muestras corran por la fuerza de la gravedad.

A medida que las muestras pasan a través de la columna, los OMV más grandes que no pueden ingresar a los poros, se mueven a través de los espacios entre partículas entre las perlas de gel para ser eluidos primero. Mientras tanto, los OMV más pequeños penetran en los poros de la matriz, toman un camino más largo y se eluyen más tarde.

Debido a su menor tamaño, los agregados de proteínas y los ácidos nucleicos ingresan a varios poros de la matriz, lo que hace que tengan el mayor tiempo de retención en la columna y se eluyan como las últimas fracciones. Recolecte eluidos OMV separados y guárdelos para su posterior análisis.

Para comenzar, use una varilla de vidrio para mezclar una botella de medio de filtración de gel y vierta el volumen requerido para llenar la columna más aproximadamente el 50% del exceso en una botella de vidrio. Deje que las perlas se asienten y decantar el exceso de líquido. Vuelva a suspender las perlas en tampón de elución a una solución final de aproximadamente 70% de gel y 30% de tampón, y desgasifique la solución al vacío.

Monte la columna en un soporte de anillo en posición vertical y llene la columna con tampón de elución para humedecer las paredes, antes de drenar el tampón hasta que solo quede aproximadamente 1 centímetro. Luego, pipetea con cuidado las perlas de gel en la columna, mientras drenas simultáneamente el exceso de tampón para evitar que las perlas se asienten, hasta que la columna esté empaquetada a una altura de aproximadamente 2 centímetros por debajo del fondo del depósito de la columna.

Antes de cargar la muestra, desgasifique el tampón de elución al vacío. Lave la columna con aproximadamente dos veces el volumen de la columna de tampón de elución. Una vez que el tampón llegue a la parte superior de la capa de gel, agregue con cuidado 2 mililitros de una muestra de vesícula de membrana externa de 100 a 200 nanomoles por litro en la parte superior de la capa de gel sin alterar la superficie, y deje que la muestra ingrese al gel.

Lentamente, agregue el tampón de elución a la columna sin alterar la capa de gel y coloque un tubo de 50 mililitros debajo de la columna. Para evitar que la columna se seque, agregue simultáneamente tampón de elución en la parte superior de la columna.

Después de recolectar 20 mililitros de eluido, coloque una gradilla de tubos de 1,5 mililitros debajo de la columna. Recoja un total de 96 fracciones de 1 mililitro en cada tubo. Mientras recolecta las muestras, agregue continuamente tampón de elución a la columna. Para limpiar la columna, pase 1 volumen de columna de hidróxido de sodio molar 0,1 a través de la columna, seguido de 2 volúmenes de columna de tampón de elución.