Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:05 min. • July 8th, 2025
Las proteínas de membrana integral bacteriana, ancladas a las membranas de bicapa lipídica, facilitan el transporte de moléculas a través de las membranas y la transducción de señales. Para estudios estructurales, las proteínas recombinantes integrales de membrana específicas se sobreexpresan con proteína fluorescente verde fusionada, GFP.
Para evaluar la estabilidad de las proteínas de membrana recombinantes después de la solubilización con detergente, obtenga una fracción de membrana bacteriana que contenga proteínas integrales de membrana marcadas con GFP. Agrega un detergente no iónico. Más allá de la concentración crítica, el detergente forma micelas.
Las micelas interactúan con las membranas lipídicas y las proteínas de la membrana, solubilizando las membranas y formando complejos proteína-detergente. Además, las regiones transmembrana hidrofóbicas de las proteínas de membrana pueden permanecer desenmascaradas, lo que provoca la agregación de proteínas. Además, las GFP libres pueden resultar debido a la degradación de las proteínas de membrana.
Centrifugar la mezcla. Recoja el sobrenadante que contiene la fracción solubilizada de detergente.
Ensamble una columna de cromatografía de exclusión por tamaño conectada a un detector de fluorescencia. La matriz de la columna comprende perlas de agarosa con tamaños de poro que definen un amplio rango de fraccionamiento.
Equilibre la columna con tampón que contenga detergente para minimizar las interacciones inespecíficas y mantener la solubilización de proteínas.
Cargue la fracción de membrana solubilizada en la columna. Los agregados de proteínas evaden los poros más grandes y se mueven a través de los espacios entre partículas entre las perlas, eluyéndose primero. Los complejos proteico-detergente más pequeños entran en unos pocos poros de las perlas, atraviesan un camino más largo y se eluyen más tarde. Las GFP libres entran en todos los poros de las perlas y eluyen al final. El detector de fluorescencia analiza las fracciones eluidas, detectando fluorescencia emitida por GFP.
Los picos de fluorescencia simétricos de los complejos proteína-detergente con agregados mínimos y GFP libre indican la idoneidad del detergente para la solubilización de proteínas de membrana.
Para la cromatografía de exclusión por tamaño detectada por fluorescencia o el análisis FSEC, a continuación, equilibre una columna de exclusión por tamaño con un amplio rango de fraccionamiento con tampón de flujo continuo a una velocidad de 0,3 mililitros por minuto. Luego, inyecte 100 microlitros de una muestra de membrana solubilizada en la columna al mismo caudal y controle el perfil de ilusión utilizando óptica de fluorescencia.