Cromatografía de gases en el espacio de cabeza: una técnica para evaluar la concentración de etanol en embriones de pez cebra

Para analizar la concentración de etanol, un compuesto orgánico volátil, comience tomando el sobrenadante de cultivo de embriones de pez cebra tratado con etanol homogeneizado en un vial de cromatografía. El sobrenadante contiene otros compuestos orgánicos no volátiles además del etanol. Coloque el vial sellado en una unidad de muestreo de conjunto de cromatografía y caliéntelo a una temperatura adecuada.

Durante el calentamiento, el etanol se vaporiza y migra a la fase gaseosa o al espacio de cabeza, dejando atrás los residuos no volátiles. Esto permite que el muestreador introduzca etanol gaseoso en un flujo continuo de gas portador. Esto actúa como una fase móvil.

El etanol pasa a través de la columna de cromatografía en espiral precalentada, que contiene un lecho empaquetado de la fase estacionaria líquida. Debido a su volatilidad y polaridad, las moléculas de etanol en movimiento comienzan a adsorberse sobre las partículas de fase estacionaria, dividiéndose en la fase estacionaria.

Debido a la alta temperatura de la columna, la adsorción de moléculas de etanol es inestable y temporal, lo que permite que estas moléculas se desorben y migren gradualmente a lo largo del flujo de gas portador. Estas moléculas de etanol experimentan una serie de eventos de adsorción-desorción a lo largo de la columna.

Posteriormente, el etanol ingresa a una cámara de detección que ayuda a determinar su concentración en la muestra correspondiente al área bajo la curva en el cromatograma resultante.

Use dos micropipetas p200 ajustadas a 50 microlitros y aspire la solución del cóctel de proteasa en una y agua en la segunda. Luego, coloque rápidamente 10 embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con una pipeta de vidrio y cierre la tapa. Repita este proceso para todas las muestras que se van a analizar, controles y embriones tratados con etanol.

Trabajando con una muestra a la vez, abra rápidamente la tapa y aspire todos los medios embrionarios residuales con una micropipeta p200 ajustada a 200 microlitros. Rápidamente, pero suavemente, agregue y retire los 50 microlitros de agua, luego, agregue los 50 microlitros de cóctel de proteasa y cierre la tapa del tubo.

Deje reposar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego, agregue rápidamente 450 microlitros de cloruro de sodio 5 molares y cierre la tapa del tubo. Homogeneizar la muestra mediante vórtice durante 10 minutos y transferir 2 microlitros de sobrenadante a un vial de cromatografía de gases. Selle el vial con una tapa de politetrafluoroetileno.

Después de completar el método de arranque, cargue 436 Etanol spme actual 2013 3 minutos absorber 2_5min ejecutar rg. METH en el menú Métodos del software de análisis para cada muestra de la lista de muestras. Complete la lista de muestras, comenzando con el aire, el agua y los 5 molares de cloruro de sodio en blanco del cóctel de proteasa. Luego, ingrese los estándares de etanol en orden de 0.3125 a 40 milimolar.

Siga los estándares con la segunda ronda de espacios en blanco. Ingrese todas las muestras de sobrenadante embrionario homogeneizado que se analizarán, de menor a mayor concentración de etanol prevista, y termine ingresando una tercera ronda de espacios en blanco.

Agregue los viales de cromatografía de gases al muestreador automático en el orden en que se ingresaron las muestras y déjelos calentar durante 10 a 15 minutos. A continuación, inicie las ejecuciones de ejemplo con el software. Una vez completadas todas las ejecuciones, active el método de apagado agregando una muestra final en la lista de muestras y ejecutando el modo de espera. METIFETAMINA. Realice una copia de seguridad de todos los datos adquiridos durante la ejecución de la muestra.

Una vez que se complete el método de apagado, haga clic en Abrir cromatograma y abra la carpeta con los resultados. Las muestras se integran automáticamente en este programa. En los resultados, asegúrese de que se hayan integrado los picos correctos. Una vez que se hayan confirmado todas las muestras, imprima o exporte los resultados.

Grafique la altura máxima de los estándares de etanol en un gráfico. A continuación, calcula los valores de pendiente, intersección con Y y R cuadrado. Obtenga el valor de etanol para cada muestra restando la altura del pico de la muestra de la intersección con Y de los patrones y dividiendo este valor por la pendiente de los estándares.

Para calcular la concentración de etanol en los embriones, calcule el factor de dilución para cada muestra y multiplique el valor de etanol de la muestra por este factor de dilución. Finalmente, calcule las muestras de referencia del medio multiplicando el valor del etanol del medio por un factor de dilución de 10.