Ensayo de inmunoperlas multianalitos: una técnica de inmunoensayo basada en flujo para la detección simultánea de múltiples subtipos de anticuerpos en muestras de suero humano

El ensayo de inmunoperlas multianalitos utiliza múltiples microesferas recubiertas de antígeno para reconocer sus correspondientes anticuerpos diana simultáneamente.

Para comenzar este ensayo, tome una mezcla de microperlas en un tubo que contenga el tampón apropiado. Cada perla está recubierta con un antígeno específico en su superficie, lo que permite una fácil diferenciación de las perlas entre sí.

Pipetee la mezcla de inmunoperlas recubierta en los pocillos de una placa de ensayo de microtitulación. Complemente los pocillos con la muestra de suero que contiene diferentes isotipos de anticuerpos diana. Estas variantes tienen diferencias sutiles en sus estructuras, lo que permite que cada pocillo tenga múltiples anticuerpos primarios.

Incubar, para permitir que los isotipos de anticuerpos de la muestra se unan a antígenos específicos capturados en las respectivas inmunoperlas. Lavar con un tampón de ensayo para eliminar los anticuerpos primarios no unidos. Agregue anticuerpos secundarios marcados con colorante fluorescente, correspondientes a cada variante de anticuerpo primario, en el pocillo.

Cada anticuerpo secundario marcado se une al sitio Fc del anticuerpo primario respectivo. Múltiples complejos antígeno-anticuerpo primario capturados con perlas están marcados con fluorescencia. Lave la placa para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.

Lea la placa utilizando un analizador fluorescente capaz de detectar simultáneamente diferentes fluoróforos en sus respectivas longitudes de onda. Dependiendo de la detección de la señal, se pueden evaluar varios isotipos de anticuerpos séricos y su unión a diferentes antígenos.

Para el rendimiento del ensayo, vuelva a suspender las microesferas acopladas mediante vórtice durante 30 segundos y sonique durante 60 a 90 segundos. Luego, retire la cantidad requerida de cada coloide de perlas del tubo respectivo y combine los coloides de perlas en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros.

A continuación, inserte el tubo en un separador magnético y deje la separación durante 60 segundos. Con el tubo aún en el separador magnético, retire el sobrenadante, sin alterar el gránulo de perlas.

Después de retirar las perlas del separador, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de ensayo. Agite durante 30 segundos antes de colocar el tubo en un separador magnético durante 60 segundos, para separar las perlas. Repita el lavado dos veces.

A continuación, ajuste la concentración de la mezcla de microesferas de trabajo de tres plex agregando un volumen apropiado de tampón de ensayo para generar una concentración final de 100 microesferas por 1 μL, para cada objetivo.

Alícuota 25 microlitros de la mezcla de microesferas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Diluya las muestras de plasma o suero 500 veces en tampón de ensayo y prepare las muestras estándar de acuerdo con la titulación deseada.

Agregue 25 microlitros de tampón de ensayo como muestra en blanco y agregue cada una de las muestras diluidas o estándar en cada pocillo designado de una placa de muestra de 96 pocillos. Cuando termine, cubra la placa con un sello de aluminio o papel de aluminio para incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de placas ajustado a 700 rotaciones por minuto.

Preparar una solución de anticuerpos antidetección humanos, o soluciones de anticuerpos secundarios, a 4 μg/ml con tampón de ensayo, como se describe en el manuscrito. Coloque la placa en un separador magnético para lavarla rápidamente y luego, invierta con fuerza la placa sobre un recipiente de riesgo biológico para eliminar el líquido de los pocillos. Con el plato aún invertido, golpee con fuerza el plato contra un grueso fajo de papel.

Luego, lave cada pocillo con 100 microlitros de tampón de ensayo y elimine el líquido mediante una inversión forzada sobre un recipiente de riesgo biológico. Repita el lavado dos veces. Después del último lavado, deseche todos los fajos de papel usados en un recipiente de riesgo biológico.

A continuación, agregue 25 microlitros de solución de trabajo de anticuerpos secundarios a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y cubra la placa con papel de aluminio para incubar en un agitador de placas a 700 rotaciones por minuto.

Después de 30 minutos de incubación, lave los pocillos de la placa dos veces con tampón de ensayo, como se demostró anteriormente. Luego, agregue 100 microlitros de tampón de ensayo en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Cubra el plato con papel de aluminio e incube durante cinco minutos en una coctelera a temperatura ambiente.

Analice una muestra de 60 microlitros a través del analizador de instrumentos de acuerdo con el manual del sistema.