Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:16 min. • July 8th, 2025
Los fosfolípidos son lípidos complejos que contienen grupos fosfato. Estas moléculas son hidrolizadas por una enzima llamada fosfolipasa.
Para realizar el ensayo de actividad de fosfolipasa, tome una emulsión de yema de huevo rica en fosfolípidos, que actúan como sustrato para la enzima. Agregue la yema a una solución tibia de agarosa que contenga cloruro de sodio, lo que mejora la estabilidad de las proteínas de la yema durante los pasos posteriores.
Complemente la mezcla con cloruro de calcio y un tinte fluorescente: rodamina. Vierta la mezcla en una placa de Petri. Tras la solidificación, los fosfolípidos de la yema permanecen distribuidos homogéneamente en la matriz de gel de agarosa.
Con un tubo, cree pocillos adecuadamente distanciados en el gel. Agregue concentraciones variables de extracto de proteína cruda que contenga fosfolipasa a los pocillos. Incube la placa a temperatura fisiológica.
La fosfolipasa del extracto se difunde radialmente en el gel. Los iones de calcio en el gel se unen a la fosfolipasa, activando las enzimas. Esta enzima escinde los fosfolípidos, generando ácidos grasos libres. Las moléculas de rodamina en el gel forman un complejo con los ácidos grasos liberados.
Tras la iluminación con luz ultravioleta, observe la aparición de halos fluorescentes alrededor de los pozos. El halo confirma la presencia de actividad enzimática. Con concentraciones más altas de fosfolipasa, las moléculas de la enzima se difunden aún más, aumentando el diámetro del halo.
Lave un huevo de gallina con SDS al 1% en agua destilada y separe la yema de huevo de la clara de huevo en condiciones estériles.
Prepare las soluciones A, B, C y D. Agregue 500 microlitros de soluciones A y C a la solución B y 100 microlitros de la solución D. Mézclelos y vierta 25 mililitros en cada placa de Petri. Espere a que la solución se solidifique en condiciones estériles y haga pozos de aproximadamente 2 a 3 milímetros de diámetro, con un tubo delgado.
Agregue un total de 20 microlitros de tampón de fosfato como control negativo en un pocillo y 20 microlitros de una fosfolipasa determinada como control positivo en otro pocillo.
Coloque diferentes cantidades de la proteína del extracto crudo: 5, 15, 25, 35 y 45 microgramos en los pocillos restantes, cada uno en un volumen final de 20 microlitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 20 horas.