Ensayo de quiralidad celular con micropatrones en forma de anillo: una técnica in vitro para determinar la quiralidad multicelular basada en la alineación celular en micropatrones en forma de anillo

Para determinar la quiralidad de las células de mamíferos in vitro, el sesgo izquierda-derecha de las células para alinearse en una orientación hacia la izquierda o hacia la derecha en condiciones de confinamiento, comience con portaobjetos recubiertos de oro fabricados a medida en una placa de múltiples pocillos que contenga medios. Los portaobjetos comprenden micropatrones de islas en forma de anillo de fibronectina promotora de la adhesión celular, rellenas con monocapa autoensamblada resistente a la adhesión celular.

A continuación, siembre un volumen apropiado de suspensión de células de mamíferos en los portaobjetos e incube. Las células se adsorben en los micropatrones de anillo que contienen fibronectina. La monocapa autoensamblada circundante evita la unión celular no específica fuera de los límites del anillo.

Reemplace el medio, eliminando las celdas sueltas, con medios nuevos. Agregue un fármaco que interfiera con la actina a un conjunto de portaobjetos e incube.

Las células adheridas proliferan, se extienden y asumen la forma de las islas de fibronectina subyacentes, mientras reorganizan sus fibras de actina en respuesta a las señales espaciales, que confinan la monocapa celular, promoviendo una alineación sesgada.

Ahora, trate los portaobjetos con paraformaldehído para la fijación celular. Bajo microscopía de contraste de fase, las células en los micropatrones de anillo aparecen como regiones oscuras con contornos brillantes alineados de acuerdo con su sesgo preferencial.

Usando software, calcule el ángulo de alineación de cada celda como la desviación de la dirección circunferencial del anillo. Promedio para determinar la quiralidad de las células de mamíferos. Las células tratadas con fármacos que interfieren con actina pueden exhibir quiralidad inversa.

Antes de sembrar las células, caliente el medio y la tripsina en un baño de agua, templado a 37 grados centígrados.

Para una mejor fijación celular, sumerja el portaobjetos estampado en una placa de 12 pocillos que contenga medios de cultivo y caliéntelo a 37 grados centígrados en la incubadora. Una vez que las células estén tripsinizadas, neutralice las células con medios que contengan FBS. Triture las células a 100 x g durante 3 minutos y luego vuelva a suspender el sedimento celular en un medio fresco. Cuente las células y diluya la suspensión celular para lograr la concentración de 200,000 células por mililitro.

Agregue 0,5 mililitros de la suspensión celular a cada pocillo que contenga un portaobjetos de oro. Agite suavemente la placa varias veces para una siembra celular uniforme, antes de incubar durante 15 minutos para la fijación celular. Después de 15 minutos, verifique la fijación celular bajo un microscopio y, si es necesario, incube durante algún tiempo más.

Una vez que las células estén adheridas, aspire el medio que contiene células no adheridas de cada pocillo y agregue 1 mililitro de medio de cultivo fresco. Cultive las células en la incubadora durante 24 horas y verifique la confluencia para determinar si se ha formado quiralidad.

Cuando se logre la confluencia requerida, fije las células retirando el medio de cultivo. Después de enjuagar con PBS una vez, agregue una solución de paraformaldehído al 4% al portaobjetos e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos, antes de enjuagar nuevamente con PBS tres veces.

Para adquirir las imágenes, use un microscopio de contraste de fase con funcionalidad de cámara y capture cada anillo en el portaobjetos en alta resolución.

Para la caracterización de la quiralidad, descargue los archivos de código de MATLAB. Agregue la carpeta de código y las subcarpetas a la ruta de MATLAB y abra el archivo "ROI_selection.m". En la línea 4, cambie el directorio a la carpeta de datos deseada.

Cambie el tamaño de la imagen en la línea 14, con las dos primeras cifras representando el tamaño del círculo interior del anillo, mientras que las otras dos representan el exterior.

Para determinar la región de interés o el ROI en las imágenes de contraste de fase, ejecute el código de MATLAB "ROI_selection.m" m haciendo clic en el botón Ejecutar. Arrastre manualmente el cuadrado de selección para que quepa en el anillo, luego, haga doble clic en la imagen para confirmar la selección.

Después de seleccionar el ROI de todas las imágenes de la carpeta, se generará un archivo ".mat" para almacenar la información del ROI de cada imagen. Luego, abra el archivo "Analysis_batch.m" y cambie el directorio de la carpeta como se demostró anteriormente. Haga clic en el botón Ejecutar para ejecutar el código "Analysis_batch.m" para determinar la quiralidad de múltiples patrones de anillos celulares.

Se generará un archivo "datatoexcel.txt", que contiene estadísticas circulares para cada anillo, así como el número de anillos en el sentido de las agujas del reloj, no quirales y antihorarios.