Ensayo de captación de vesículas extracelulares: un método para visualizar y cuantificar la captación celular de vesículas extracelulares mediante la técnica de imágenes de fluorescencia 3D

Para facilitar la comunicación celular, las células secretan vesículas extracelulares, EV, estructuras de tamaño nanométrico encerradas por una membrana lipídica. Los vehículos eléctricos transportan diversas cargas biológicas, incluidas macromoléculas y metabolitos, para entregarlos a las células receptoras.

Para visualizar la captación de VE por parte de las células mediante microscopía confocal, primero, tome VE recién aislados. Estos EV están premarcados con anticuerpos unidos a una sonda fluorescente para su posterior fácil visualización.

Agregue un volumen adecuado de EV marcados con fluorescencia a un cultivo celular receptor adherente. Incubar durante el período deseado. Durante la incubación, una subpoblación de las VE marcadas se adhiere superficialmente a la superficie celular, mientras que otras VE se internalizan.

Agregue un tinte fluorescente diferente para etiquetar el citoplasma celular, lo que ayuda a distinguir las EV internalizadas de las adheridas a la célula receptora. Coloque las células bajo un microscopio confocal y obtenga imágenes en diferentes planos focales a lo largo del eje z, adquiriendo una serie de secciones ópticas a lo largo del grosor de la muestra.

Compile esta colección de secciones ópticas, una pila z, para formar una imagen de muestra tridimensional de alta resolución. Aplique renderizado virtual, un proceso posterior a la creación de imágenes, para reconstruir las superficies celulares.

Para diferenciar los EV adheridos superficialmente de los internalizados, repréndalos como puntos de diferentes tonos. Calcule el volumen de celda y el número de EV internalizados por ellas, cuantificando la absorción de EV por celda.

Siembre 4 x 10 4 células PC3 en un plato de 35 mililitros con medios de 1 mililitro. Deje que las células se adhieran durante la noche en condiciones óptimas de cultivo celular. Al día siguiente, lave las células adheridas dos veces con medios agotados en exosomas.

Después de diluir los EV marcados con fluorescencia a la concentración adecuada utilizando medios agotados en exosomas, agregue los EV diluidos a las células diana adheridas e incube durante el tiempo experimental deseado. Después de eliminar las VE no internalizadas lavando las células tres veces con medios libres de exosomas, marque el citoplasma de las células adheridas con 1 μg/ml de CMTMR e incube en condiciones óptimas de cultivo celular.

Para obtener imágenes de células vivas, coloque las células preparadas en la incubadora en el escenario. Después de configurar los parámetros de imagen basados en muestras de control, determine la profundidad de las células objetivo y el rango de tamaño de apilamiento en la dirección z para adquirir imágenes confocales 3D. A continuación, configure la adquisición de imágenes en varias imágenes apiladas en z de tinte específico de célula y tinte específico de EV simultáneamente.

Para el procesamiento de imágenes, utilice un software de procesamiento automático de imágenes.

Para construir superficies virtuales de las celdas, haga clic en 'Agregar nuevas superficies'. Para configurar las superficies de celdas virtuales, haga clic en el botón '+ Agregar' y seleccione 'Calidad' como "Tipo de filtro". Establezca el umbral del valor apropiado para el límite inferior mediante inspección visual, establezca el valor máximo para el límite superior y haga clic en el botón 'Finalizar'.

A continuación, para construir los puntos virtuales de los vehículos eléctricos, haga clic en el botón 'Agregar nuevos lugares'. En "Configuración del algoritmo", seleccione 'Diferentes tamaños de punto' y 'Cálculo de la distancia más corta'. Luego, haga clic en 'Siguiente' y seleccione "Canal 1 - Alexa Fluor 488" como "Canal de origen". Ingrese el valor apropiado para el 'Diámetro XY estimado' en "Detección puntual" y haga clic en 'Siguiente'.

Para configurar los puntos EV virtuales, haga clic en el botón '+ Agregar' y seleccione 'Calidad' como 'Tipo de filtro'. Establezca el "Umbral inferior" mediante una inspección visual y haga clic en 'Siguiente'. Para el "Tipo de regiones puntuales", seleccione 'Intensidad absoluta', luego haga clic en 'Siguiente'.

Para establecer un umbral en la región de puntos EV, introduzca el valor adecuado para "Umbral de región" mediante inspección visual. Seleccione "Diámetro desde" en "Volumen de región" y haga clic en "Finalizar".

Para dividir los puntos agrupados dentro de la superficie construida, haga clic en los 'Puntos' construidos y vaya a 'Filtros'. A continuación, haga clic en el botón 'Agregar' y seleccione 'Distancia más corta a superficies Superficies = Superficie 1' como "Tipo de filtro".

Después de establecer el umbral más bajo para el límite inferior y el valor apropiado para el límite superior, haga clic en el botón 'Duplicar sección en los nuevos lugares'.

Para el recuento automático de EV dentro de las celdas, haga clic en la 'Selección de puntos 1' construida, vaya a 'Estadísticas' y exporte el valor de 'Número total de puntos'.

Para obtener el número de celdas, haga clic en 'Superficies 1' construidas, luego, vaya a 'Estadísticas' y exporte el valor de "Número total de superficies" desde 'General'. Finalmente, vaya a la pestaña 'Detallado' en 'Estadísticas' para exportar el volumen.