Ensayo de Actividad de Citrato Sintasa: Un ensayo colorimétrico para medir la actividad mitocondrial de la citrato sintasa en el homogeneizado de tejidos de Drosophila

Dentro de las mitocondrias, la citrato sintasa, localizada en la matriz de la membrana mitocondrial interna, es la enzima limitante de la velocidad que cataliza la reacción entre la acetilcoenzima A y el ácido oxaloacético para formar citrato, el primer paso del ciclo del ácido cítrico.

Para analizar la actividad de la citrato sintasa, transfiera tórax adultos de mosca Drosophila abundantes en mitocondrias a un tubo lleno de un tampón de extracción refrigerado que contiene ácido etilendiaminotetraacético, EDTA y un detergente no iónico.

Homogeneizar los tejidos del tórax sobre hielo para evitar la desnaturalización de las proteínas mediada por el calor. La fuerza de cizallamiento aplicada, junto con los detergentes, lisa el tejido y libera componentes intracelulares, incluidas las mitocondrias.

Además, la ruptura de la membrana mitocondrial interna conduce a la liberación de proteínas de la matriz mitocondrial, incluida la citrato sintasa. El EDTA se une a cationes divalentes e inhibe la actividad de la proteasa, evitando así la degradación de las proteínas.

Diluya el homogeneizado con tampón de extracción y agregue un volumen apropiado a la mezcla de reacción que contiene pocillos