Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:44 min. • July 8th, 2025
Dentro de las mitocondrias, la citrato sintasa, localizada en la matriz de la membrana mitocondrial interna, es la enzima limitante de la velocidad que cataliza la reacción entre la acetilcoenzima A y el ácido oxaloacético para formar citrato, el primer paso del ciclo del ácido cítrico.
Para analizar la actividad de la citrato sintasa, transfiera tórax adultos de mosca Drosophila abundantes en mitocondrias a un tubo lleno de un tampón de extracción refrigerado que contiene ácido etilendiaminotetraacético, EDTA y un detergente no iónico.
Homogeneizar los tejidos del tórax sobre hielo para evitar la desnaturalización de las proteínas mediada por el calor. La fuerza de cizallamiento aplicada, junto con los detergentes, lisa el tejido y libera componentes intracelulares, incluidas las mitocondrias.
Además, la ruptura de la membrana mitocondrial interna conduce a la liberación de proteínas de la matriz mitocondrial, incluida la citrato sintasa. El EDTA se une a cationes divalentes e inhibe la actividad de la proteasa, evitando así la degradación de las proteínas.
Diluya el homogeneizado con tampón de extracción y agregue un volumen apropiado a la mezcla de reacción que contiene pocillos de la placa de pocillos múltiples. La mezcla de reacción comprende acetil coenzima A, ácido oxaloacético y ácido ditionitrobenzoico.
La citrato sintasa en el homogeneizado cataliza la reacción entre el ácido oxaloacético y la acetil coenzima A, formando citrato y coenzima A con un grupo tiol. El grupo tiol reacciona con el ácido ditionitrobenzoico incoloro, formando un producto amarillo, el ácido tionitrobenzoico.
Con un lector de microplacas, mida la absorbancia de la solución de color amarillo. La absorbancia podría estar relacionada con la actividad de la citrato sintasa en el homogeneizado tisular.
Transfiera 10 tórax de mosca adulta a 100 microlitros de tampón de extracción helado inmediatamente y homogeneícelos con un mortero sobre hielo. Mantenga las muestras frías homogeneizando durante cinco a 10 segundos en hielo, dejándolas reposar en hielo durante cinco segundos, luego repitiendo hasta que todos los tejidos estén completamente homogeneizados.
Alícuota 10 microlitros de cada muestra homogeneizada en un nuevo tubo para medir el contenido de proteínas, manteniendo estos tubos también en hielo. Agregue 400 microlitros de tampón de extracción helado a cada muestra restante para un volumen total de 500 microlitros, y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar.
Para cada reacción, agregue 1 microlitro de lisado celular diluido a 150 microlitros de la solución de reacción recién preparada. Mezcle bien pipeteando suavemente, asegurándose de evitar la formación de burbujas. Luego, use un lector de placas para medir la absorbancia a 412 nanómetros cada 10 a 30 segundos durante cuatro minutos a 25 grados Celsius.
Grafique los datos como absorbancia a lo largo del tiempo y, a continuación, calcule la pendiente de la parte lineal de la curva. Finalmente, divida la velocidad de reacción o pendiente por la concentración de proteína de la muestra para normalizar la actividad de la citrato sintasa.