JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:03 min • July 8th, 2025
En los tejidos, el hierro, un mineral esencial crucial para diversos procesos metabólicos, normalmente existe secuestrado en hemoproteínas y proteínas de hierro no hemo. Las hemoproteínas incluyen hierro ferroso o hemo unido a anillos de porfirina, mientras que las proteínas de hierro no hemo carecen de la estructura del anillo de porfirina y comprenden principalmente hierro férrico o no hemo.
Para estimar el contenido de hierro no hemo en el tejido hepático de ratón, trate un fragmento de tejido hepático de ratón seco y recolectado con bajas concentraciones de ácido clorhídrico y ácido tricloroacético. Incubar a altas temperaturas para digerir el tejido y facilitar la precipitación de proteínas inducida por ácido.
Debido a las bajas concentraciones de ácido, el hierro no hemo se libera de las proteínas asociadas. El hierro hemo, al estar unido al anillo de porfirina, no se ve afectado.
Después de enfriar, transfiera el volumen deseado de sobrenadante que contenga hierro no hemo a una placa de pocillos múltiples. Añadir el quelante de hierro cromogénico, sulfonato de batofenantrolina, BPS, suplementado con ácido tioglicólico, un agente reductor, en tampón adecuado e incubar.
El ácido tioglicólico reduce todo el hierro férrico no hemo a hierro ferroso, que puede unirse fácilmente al BPS en una proporción de 1:3, formando un complejo altamente estable de color rosa. Además, el ácido tioglicólico evita la interferencia debido a cualquier catión metálico divalente contaminante como el cobre que pueda interactuar con el BPS.
Coloque la placa de pocillos múltiples en un lector de microplacas para medir la absorbancia de los complejos ferrosos rosados de BPS, representativos de la concentración de hierro no hemo en el fragmento de tejido hepático de ratón.
Transfiera cada trozo de tejido seco a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 1 mililitro de la mezcla ácida al tubo y ciérrelo. Prepare un ácido en blanco de la misma manera, excepto que aquí se omite el tejido.
Incube los tubos a 65 grados centígrados durante 20 horas para digerir el tejido.
Después de enfriar a temperatura ambiente, use una micropipeta equipada con puntas de plástico para transferir 500 microlitros del extracto ácido transparente a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Prepare las reacciones de cromógeno directamente en las microplacas de poliestireno de fondo plano, transparentes y sin tratar. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Mida la absorbancia de la muestra en un lector de placas a una longitud de onda de 535 nanómetros contra una referencia de agua desionizada.