Ensayo pull-down de molécula única para el análisis de fosforilación de proteínas: una técnica de alto rendimiento para cuantificar la fosforilación de proteínas en el lisado celular

La fosforilación de ciertas proteínas celulares es importante para su función biológica.

Para cuantificar los niveles de fosforilación de proteínas intactas mediante un ensayo desplegable de una sola molécula, comience tomando un cubreobjetos de vidrio con un patrón de matriz de cuadrícula. Cada compartimento está recubierto con polietilenglicol biotinilado o enlazadores basados en PEG interespaciados con PEG normal para evitar obstáculos estéricos durante la unión a proteínas.

Trate el cubreobjetos con un reactivo reductor para minimizar la autofluorescencia en el análisis. Superponga el cubreobjetos con neutravidinas (proteínas de unión a biotina) e incube, lo que les permite unirse a los enlazadores PEG biotinilados.

Complemente la matriz con anticuerpos específicos contra proteínas diana. Cada anticuerpo contiene biotina unida a su región Fc, que ayuda a anclar el anticuerpo a la neutravidina, provocando la inmovilización.

Ahora, agregue el lisado de cultivo celular que contiene varias proteínas, incluidas las variantes fosforiladas y no fosforiladas marcadas con fluorescencia verde de la proteína objetivo, e incube. Ambas variantes de la proteína diana son capturadas por los anticuerpos, formando complejos. Lavar para eliminar las proteínas no unidas.

A continuación, trate estos complejos con el segundo conjunto de anticuerpos marcados con fluorescencia roja, que se unen exclusivamente a los residuos fosforilados de la proteína, impartiendo una señal de fluorescencia diferente al complejo.

Tome imágenes de la matriz bajo un microscopio de fluorescencia y observe dos señales de fluorescencia distintas. La colocalización de ambas señales de fluorescencia indica la presencia de proteínas fosforiladas en la muestra.

Retire las matrices funcionalizadas de biotina-PEG del congelador y equilibre a temperatura ambiente. Coloque el cubreobjetos con la matriz hacia arriba sobre una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros forrada con una película de sellado. Incube cada cuadrado de la matriz con 10 miligramos por mililitro de borohidruro de sodio y PBS durante 4 minutos a temperatura ambiente. Lavar tres veces con PBS.

A continuación, incube con 0,2 miligramos por mililitro de NeutrAvidina en T50 durante 5 minutos, seguido de lavado tres veces con T50-BSA. Repita la incubación con 2 microgramos por mililitro de anticuerpo específico de POI biotinilado en T50-BSA durante 10 minutos, seguido de lavado.

Primero, descongele y mezcle el lisado mediante pipeteo. Diluir 1 microlitro del lisado en 100 microlitros de T50-BSA/PPI helado. Incube el lisado en la matriz durante 10 minutos, seguido de lavado. Prepare el anticuerpo antifosfotirosina conjugado con AF647 en T50-BSA/PPI helado e incube en la matriz durante 1 hora.

Deposite una gota de aceite en el objetivo. Coloque la nanorred en el escenario para obtener imágenes. Usando luz blanca transmitida, concéntrese en el patrón de cuadrícula. Adquiere una serie de 20 imágenes de la cuadrícula. Asegúrese de que los píxeles no estén saturados y guarde la serie de imágenes como "Fiducial".

Desenfoca la nanorred para crear un patrón Airy. Adquiera una serie de 20 imágenes para calibraciones de ganancia y guarde la imagen como "Ganancia". Luego, adquiera una serie de 20 imágenes para el desplazamiento de la cámara bloqueando toda la luz de la cámara y guarde la imagen como "Fondo".

Para adquirir imágenes de SiMPull, primero, limpie el objetivo de aceite y deposite aceite adicional en el objetivo. Asegure la matriz de cubreobjetos en la platina del microscopio. Adquiera imágenes para cada muestra, primero en el canal rojo lejano, seguido de fluoróforos de menor longitud de onda. Verifique el nivel de amortiguación cada 30 a 45 minutos y reponga según sea necesario.