Ensayo pull-down de molécula única para el análisis de fosforilación de proteínas: una técnica de alto rendimiento para cuantificar la fosforilación de proteínas en el lisado celular
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 4:14 min. • July 8th, 2025
La fosforilación de ciertas proteínas celulares es importante para su función biológica.
Para cuantificar los niveles de fosforilación de proteínas intactas mediante un ensayo desplegable de una sola molécula, comience tomando un cubreobjetos de vidrio con un patrón de matriz de cuadrícula. Cada compartimento está recubierto con polietilenglicol biotinilado o enlazadores basados en PEG interespaciados con PEG normal para evitar obstáculos estéricos durante la unión a proteínas.
Trate el cubreobjetos con un reactivo reductor para minimizar la autofluorescencia en el análisis. Superponga el cubreobjetos con neutravidinas (proteínas de unión a biotina) e incube, lo que les permite unirse a los enlazadores PEG biotinilados.
Complemente la matriz con anticuerpos específicos contra proteínas diana. Cada anticuerpo contiene biotina unida a su región Fc, que ayuda a anclar el anticuerpo a la neutravidina, provocando la inmovilización.
Ahora, agregue el lisado de cultivo celular que contiene varias proteínas, incluidas las variantes fosforiladas y no fosforiladas marcadas con fluorescencia verde de la proteína objetivo, e incube. Ambas variantes de la proteína diana son capturadas por los a
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