JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:25 min • July 8th, 2025
En las células metabólicamente activas, los sustratos que contienen carbono se oxidan a través de una serie de reacciones bioquímicas para generar energía y liberar dióxido de carbono como subproducto.
Para determinar la tasa de oxidación del sustrato, comience con un cultivo adherente de las células indiferenciadas deseadas. Complemente las células en un medio con un sustrato adecuado que contenga carbono radiactivo catorce en su columna vertebral e incube.
Las células consumen el sustrato y lo oxidan para liberar dióxido de carbono radiomarcado, que se difunde fuera de las células hacia el medio circundante.
Transfiera este medio a un conjunto de captura de gas que contenga ácido perclórico para enfriar la reacción. Este tubo contiene un papel de filtro empapado en hidróxido de sodio colocado dentro de la tapa del tubo. Cierre la tapa e incube.
Durante la incubación, el dióxido de carbono, en su forma gaseosa, se libera dentro del tubo. El hidróxido de sodio absorbe el dióxido de carbono radiomarcado y lo atrapa en el papel de filtro. Transfiera este papel de filtro a un vial que contenga un cóctel de centelleo y colóquelo dentro del mostrador de centelleo líquido.
Dentro del mostrador, el carbono radiomarcado sufre una desintegración radiactiva, emitiendo partículas beta de alta energía. Estas partículas son absorbidas por los componentes del cóctel de centelleo y emiten pulsos de luz, que son calculados por el contador de centelleo.
La cantidad de radiactividad detectada se correlaciona con la tasa de oxidación del sustrato en las células.
Lave las células en los pocillos adicionales, dos veces con DPBS. Disociar las células con tripsina-EDTA al 0,25%. Vuelva a suspender 20 microlitros de células digeridas en DPBS con 20 microlitros de solución de colorante de naranja de acridina y yoduro de propidio. Determine el número de células vivas con un contador de células automatizado y registre el número.
Lave las células en los pocillos de ensayo dos veces con DPBS. Agregue 500 microlitros de medio caliente a cada pocillo de ensayo en la campana de cultivo de tejidos designada por RAM. Después de sellar la placa con parafilm, incube las células en una incubadora designada por RAM a 37 grados Celsius durante cuatro horas.
Durante la incubación, corte el papel de filtro en trozos circulares ligeramente más grandes que el área dentro de la tapa del tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e inserte el papel cómodamente en la tapa. Agregue 200 microlitros de ácido perclórico molar a cada tubo y 20 microlitros de hidróxido de sodio al papel de filtro colocado dentro de la tapa.
Después de incubar las células, transfiera 400 microlitros de medio de cultivo de cada pocillo a los tubos preparados y cierre las tapas inmediatamente. Deje los tubos en una gradilla para tubos a temperatura ambiente durante 1 hora.
Paralelamente, durante la incubación, coloque un vial de centelleo para cada tubo y llénelo con 4 mililitros de líquido de centelleo. Transfiera cada trozo de papel de filtro a un vial de centelleo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Realice pruebas de limpieza en la campana de cultivo de tejidos, el baño de agua, el refrigerador, la incubadora, el fregadero, el suelo y cualquier otra área de trabajo para detectar una posible contaminación de RAM. Coloque las toallitas de papel en viales de centelleo que contengan líquido de centelleo.
Mida la radiactividad de carbono-14 en los viales de centelleo con un contador de centelleo y registre los resultados de la lectura. Descontamine el entorno de trabajo de acuerdo con las pautas de seguridad radiológica, si es necesario.