Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 4:02 min. • July 8th, 2025
Las septinas son proteínas citoesqueléticas clave que se unen a las superficies curvas de la membrana plasmática.
Para observar el ensamblaje de septina in vitro en microesferas, primero, tome una suspensión de perlas de sílice microscópicas de tamaño uniforme, que actúan como soporte sólido para la formación de bicapas. Agite esta suspensión para romper cualquier grupo de cuentas.
Complételo con pequeñas vesículas unilamelares, SUV: vesículas esféricas rodeadas por una sola bicapa lipídica. Incubar con agitación constante, evitando que las microesferas se asienten.
Durante la incubación, los grupos de cabezas polares externas facilitan la adsorción de SUV en la superficie de la microesfera hidrofílica. Esta interacción hace que los SUV se rompan, seguida de la fusión de los lípidos de los SUV en la superficie curva de la microesfera como una capa continua, lo que da como resultado una formación de bicapa lipídica esférica y soportada, SLB.
Lavar para eliminar el exceso de lípidos no unidos y volver a suspender en tampón de reacción. Transfiera la suspensión esférica de SLB a una pequeña región de una superficie recubierta de polietilenglicol, para evitar adsorciones inespecíficas. Agregue una suspensión de septina marcada con fluorescencia a la cámara e incube.
Las septinas forman heterooligómeros que reconocen la curvatura positiva de los SLB esféricos, polimerizándose para formar filamentos. Eventualmente, los filamentos de septina interactúan entre sí, lo que lleva a la formación de estructuras de orden superior.
Observe los SLB recubiertos de septina bajo un microscopio de fluorescencia de alta resolución. La presencia de fluorescencia indica una deposición sensible a la curvatura de la septina.
Primero, agite la botella que contiene microesferas de sílice durante 15 segundos. Luego, bañe y sonique durante un minuto y vuelva a agitar durante 15 segundos para romper los racimos. Mezcle las perlas con SLBB y 10 microlitros de SUV de 5 milimolares en un tubo de microcentrífuga de baja adherencia.
Incube la mezcla de perlas y lípidos durante una hora a temperatura ambiente, en un agitador para evitar la sedimentación. Mientras tanto, descongele un cubreobjetos pegilado y péguele un tubo de PCR cortado de 0,2 mililitros. Después de la incubación, centrifugar las perlas durante 30 segundos en el RCF designado.
Después del primer giro, retire 50 microlitros de sobrenadante. A continuación, añadir 200 microlitros de PRB y mezclar mediante un pipeteo vigoroso. Para las siguientes rondas, retire 200 microlitros de PRB y agregue otros 200 microlitros después del segundo y tercer giro, y agregue 220 microlitros de PRB después del cuarto giro.
Si realiza un ensayo de competencia con varios tamaños de perlas, prepare la reacción mezclando volúmenes iguales de cada tamaño de perlas y diluyendo 29 microlitros de esta mezcla de perlas con 721 microlitros de tampón de reacción. Luego, agregue 75 microlitros de perlas diluidas y 25 microlitros de la proteína diluida en SSB a los pocillos y mezcle.
Si mide septinas en un estado estacionario, incube la mezcla a temperatura ambiente durante una hora y luego, obtenga una imagen por microscopía confocal o casi TIRF.