Ensayo de separación de fases de proteínas: un método optogenético para la separación de fases de proteínas de unión a ARN mutante en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra

Las proteínas de unión al ARN nuclear, RBP, son proteínas multifuncionales compuestas por regiones ordenadas con una estructura tridimensional bien definida y regiones menos estables e intrínsecamente desordenadas, IDR.

En varias enfermedades neurodegenerativas, las mutaciones específicas de IDR hacen que las RBP se localicen erróneamente en el citoplasma y participen de manera aberrante en interacciones débiles, formando inclusiones dinámicas sin membrana, un fenómeno llamado separación de fases. Eventualmente, estas inclusiones maduran en agregados tóxicos e insolubles, lo que resulta en disfunción y degeneración neuronal.

Para investigar la separación de fases de RBP in vivo utilizando optogenética, comience con una larva de pez cebra transgénica anestesiada y descorionada, que expresa un RBP mutado en IDR fusionado con un reportero fluorescente y un dominio fotorreceptor sensible a la luz azul, en un tampón adecuado.

A continuación, monte la larva lateralmente en una gota de agarosa fundida para obtener imágenes de la médula espinal. Deje que la agarosa se solidifique, inmovilizando la larva. Usando un microscopio confocal, adquiera imágenes de la médula espinal para visualizar