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Técnicas biológicas
0 vistas • 4:08 min • July 8th, 2025
La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los vasos sanguíneos existentes durante condiciones patológicas y de desarrollo. La comunicación extensa entre las células endoteliales que recubren la superficie interna de los vasos sanguíneos y los pericitos circundantes, células de soporte en el lado externo de los vasos sanguíneos, es crucial para la angiogénesis.
Para estudiar la angiogénesis in vitro, comience con células endoteliales y microperlas microtransportadoras recubiertas de pericitos suspendidas en una solución de fibrinógeno, una glicoproteína soluble que actúa como precursor de fibrina.
Ahora, pipetee la suspensión de perlas en una placa de cultivo que contenga una solución de trombina, una enzima proteolítica, e incube. La trombina se une a la molécula de fibrinógeno, lo que hace que su escisión forme monómeros de fibrina insolubles, formando gel de fibrina polimérico. Este paso asegura la inclusión de perlas recubiertas de células en el gel de fibrina.
A continuación, coloque un cultivo de fibroblastos (células precursoras del tejido conectivo) sobre el gel de fibrina e incube para permitir la activación de los fibroblastos.
Durante la incubación, los fibroblastos secretan factores cruciales de crecimiento angiogénico que desencadenan la activación de las células endoteliales. En combinación, los pericitos adherentes y las células endoteliales secretan moléculas de señalización que ayudan a que las células endoteliales broten en el gel de fibrina.
Los brotes endoteliales aparecen como protuberancias celulares alargadas envueltas en pericitos, que representan la etapa temprana de la angiogénesis.
Examine las placas de perlas recubiertas de microportadores bajo el microscopio con un aumento de 20 veces para confirmar que todas las perlas han sido suficientemente recubiertas por las células endoteliales.
Transfiera las placas a una campana de flujo laminar y use una pipeta P1000 para aspirar y dispensar vigorosamente las soluciones de perlas recubiertas para separar las celdas de los fondos de la placa y transferir los sobrenadantes a tubos individuales.
Deje que las cuentas se asienten en el fondo de los tubos durante tres minutos. A continuación, utilice la pipeta P1000 para eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadantes sin alterar los grupos de perlas. Vuelva a suspender las perlas en un mililitro de medio completo por tubo y deje que las perlas se asienten durante 30 a 60 segundos. Utilice la pipeta P1000 para aspirar el sobrenadante de nuevo y lave las células endoteliales flotantes de la suspensión de perlas con medio completo nuevo, dos veces más, como se acaba de demostrar.
Después del tercer lavado, vuelva a suspender las perlas en 2,5 mililitros de solución de fibrinógeno. Agregue 13 microlitros de solución de trombina por pocillo, en una placa inferior de vidrio de 24 pocillos. Luego, agregue 0,5 mililitros de la solución de perlas / fibrinógeno a cada pocillo, teniendo cuidado de pipetear cuidadosamente las perlas directamente en la trombina, y pipetee lentamente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces para mezclar bien las soluciones.
Cuando se hayan sembrado todos los pocillos, deje que la solución de trombina-fibrinógeno se coagule previamente en la campana de flujo laminar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, transfiera con cuidado la placa a una incubadora de 37 grados Celsius durante 1,5 a 2 horas adicionales.
Cuando el gel se haya solidificado por completo, vuelva a suspender los fibroblastos pulmonares humanos normales a una concentración de 2 x 104 células por mililitro en medio completo y agregue un mililitro de fibroblastos a cada pocillo. Luego, regrese la placa a la incubadora de cultivo celular.