Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:55 min. • July 8th, 2025
Para evaluar el potencial de un compuesto larvicida de prueba, un antagonista del receptor de dopamina, utilizando un ensayo de contacto larvario, comience con larvas de mosquitos vivas en su etapa de desarrollo o estadio deseado en medios acuosos. Transfiera un número igual de larvas a los pocillos de una placa de pocillos múltiples.
Reemplace el medio en los pozos con agua desionizada para evitar cualquier interferencia de contaminantes que puedan afectar negativamente a las larvas. Agregue concentraciones crecientes del compuesto de prueba a los pocillos respectivos.
Gire suavemente la placa para facilitar el contacto entre las larvas y el compuesto de prueba. Incube la placa en condiciones adecuadas.
Al entrar en contacto con las larvas, el compuesto de prueba ingresa a la pared del cuerpo o capa más externa y llega a los espiráculos, aberturas del sistema traqueal, que están conectados a los ganglios, grupo de células nerviosas, que comprenden el sistema nervioso central.
En las células nerviosas, el compuesto de prueba se une a los sitios de unión secundarios de los receptores de dopamina, que están involucrados en procesos celulares críticos. Esta unión, incluso con el neurotransmisor dopamina unido al receptor de dopamina, evita la activación del receptor y la señalización posterior, interrumpiendo el desarrollo larvario y, en última instancia, causando la muerte.
Registre el número de larvas que no responden, sin movimiento, en cada pocillo en un momento específico después de la exposición al compuesto de prueba en concentraciones variables de compuestos.
El aumento de la tasa de mortalidad larvaria con el aumento de la concentración indica el potencial larvicida del compuesto de prueba.
Para comenzar, etiquete los pocillos de una placa transparente de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Utilice una balanza analítica para pesar el compuesto de prueba. Luego, disuelva el compuesto en agua estéril de doble destilación en un tubo de 1,5 mililitros, lo que da como resultado una solución madre de 80 milimolares. A continuación, diluya en serie la solución madre con agua doble destilada para preparar soluciones madre de trabajo de las concentraciones deseadas.
Tenga en cuenta que se debe tener cuidado cuando se agregan las larvas a los pozos, durante la eliminación del exceso de agua y cuando se agrega la química de prueba, para evitar daños físicos a las larvas. La lesión puede aumentar la mortalidad y, por lo tanto, producir resultados falsos positivos o invalidar el ensayo.
Utilice una pipeta de transferencia de plástico de gran calibre para transferir cinco larvas de tercer estadio a cada pocillo de la placa. A continuación, utilice una pipeta de 1 mililitro para eliminar suavemente el agua y sustitúyala por el volumen deseado de agua doblemente destilada.
Tenga cuidado de no tocar las larvas al retirar el agua. Trabaje rápidamente para asegurarse de que las larvas no se sequen y agregue suavemente la química de prueba pipeteando contra el lado opuesto del pozo de plástico.
Agregue un volumen apropiado de solución de prueba a cada pocillo y gire suavemente la placa para garantizar una mezcla uniforme. Coloque la placa en una cámara de crecimiento, manteniendo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a 25 grados centígrados con una humedad relativa del 75% al 85%.
Para verificar el movimiento de las larvas, golpee suavemente la placa. Si no se observa ningún movimiento, toque suavemente la larva con un palillo estéril. Marque la larva como muerta si no se nota respuesta y use una hoja de puntuación para registrar el número total de larvas muertas en cada pocillo en los puntos de tiempo descritos en el protocolo de texto.