Ensayo de formación de agregados de proteínas: un método para detectar y cuantificar la agregación de proteínas en células cultivadas tras la inducción por inhibidor del proteasoma

La eliminación de proteínas mal plegadas en la célula está regulada principalmente por el sistema celular ubiquitina-proteasoma, en el que la proteína es reconocida y etiquetada por primera vez por ubiquitina, una pequeña proteína reguladora, y traficada al proteasoma, un complejo multiproteico, para su hidrólisis y eliminación.

La alteración de la actividad del sistema ubiquitina-proteosoma, una ocurrencia común en enfermedades neurodegenerativas, puede hacer que las proteínas mal plegadas se acumulen dentro de las células, formando agregados de proteínas insolubles con efectos citotóxicos.

Para visualizar y cuantificar la agregación de proteínas in vitro, obtenga una suspensión de células de mamíferos transducidas, que expresan una proteína mutante marcada con fluorescencia que adopta una conformación mal plegada con residuos hidrófobos expuestos, en medios adecuados.

Pipetee concentraciones crecientes de un inhibidor del proteasoma en los pocillos de una placa negra de pocillos múltiples para minimizar la fluorescencia de fondo durante la obtención de imágenes. Siembre la suspensión de células de mamíferos en los pocillos. Incubar para permitir que las células se adhieran al fondo de la placa y proliferen.

Una vez dentro, el inhibidor del proteasoma se une a los sitios proteolíticos del proteasoma y bloquea su actividad, lo que hace que se acumulen las proteínas mutantes expresadas, que luego interactúan a través de sus residuos hidrofóbicos expuestos y forman agregados citoplasmáticos, lo que finalmente conduce a la muerte celular.

Agregue un tinte fluorescente de unión al ADN para teñir los núcleos celulares. Imagen de la placa. Los agregados de proteínas mutantes fluorescentes aparecen dispersos dentro del citoplasma sin teñir.

Los pocillos que contienen concentraciones más altas de inhibidores del proteasoma exhiben una mayor proporción de números agregados de proteínas a recuento de células que los pocillos con concentraciones más bajas de inhibidores del proteasoma.

Para la transferencia de compuestos, en una placa de polipropileno de almacenamiento de 384 pocillos, agregue diluciones en serie de compuestos por la serie de dilución estándar de 1 a 3. Luego, utilizando un manipulador de líquidos equipado con un cabezal capilar 384, distribuya 0,25 microlitros de inhibidores del proteasoma en placas de ensayo negras vacías de fondo plano de 384 pocillos. Luego, siembre 1.5 x 10⁴ celdas en estas placas. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.

Antes de obtener imágenes de la línea celular tratada con inhibidores del proteasoma, agregue 10 microlitros de DMEM precalentado con solución de tinción e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Después de la tinción, inicie el software de funcionamiento automatizado del microscopio seleccionando la pestaña "Microscopio". Primero, seleccione la pestaña "Configuración" y luego, seleccione el objetivo 20X y el tipo de placa correcto.

Para permitir un enfoque adecuado con diferentes tipos de placas, asegúrese de que el "Collar" esté configurado en el valor correcto en el objetivo.

A continuación, seleccione 'Exposición 1', establezca la altura de enfoque en '0 micrómetros', luego seleccione "Enfoque". Una vez enfocado, exponga la cámara 1.

Para optimizar el plano de exposición, ajuste la altura de enfoque y haga clic en "Tomar altura". Cambie los tiempos de exposición en la potencia del láser para una intensidad máxima de píxeles de aproximadamente 3.000 y guarde los parámetros de exposición.

Seleccione la pestaña "Definición de experimento". Cree un diseño y un subdiseño. A continuación, arrastre y suelte el diseño, la exposición, la imagen de referencia, el archivo de recorte sesgado y el subdiseño relevantes. A continuación, guarde el experimento.

Finalmente, seleccione la pestaña "Experimento automático" y adquiera imágenes. Para imágenes de 2 canales, primero seleccione el algoritmo de software para segmentar los objetos primarios, como núcleos, citosol y agregados.