JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:38 min • July 8th, 2025
La endotoxina, una toxina bacteriana gramnegativa presente en la membrana externa, es un lipopolisacárido, LPS, compuesto principalmente por lípidos y polisacáridos, incluidos los lípidos A y el antígeno O. Cuando se libera durante la infección, es reconocido por el sistema inmunológico, desencadenando respuestas inflamatorias basadas en citoquinas.
Para estimar la contaminación por endotoxinas en una nanoformulación de fármacos liposomales utilizando el lisado de amebocitos de Limulus, ensayo LAL, prepare tubos de reacción, uno que contenga el fármaco y el otro que contenga el fármaco enriquecido con una concentración de endotoxinas conocida.
Agregue reactivo LAL que contenga lisado de proteínas obtenido de cangrejo herradura, Limulus polyphemus, células sanguíneas o amebocitos. El lisado incluye serina proteasas inactivas (factor B, factor C, enzima procoagulante) y una proteína de coagulación en gel, coagulógeno.
Agite los tubos y cárguelos en un turbidímetro para medir la turbidez de las soluciones.
En presencia de LPS contaminantes unidos a fármacos liposomales, el factor C sensible al LPS se activa autocatalíticamente, que luego escinde y activa el factor B que convierte la enzima procoagulante en enzima coagulante. Esta enzima activada escinde los enlaces peptídicos coagulógenos, formando monómeros de coagulina.
Eventualmente, los monómeros se polimerizan a través de interacciones entre las regiones hidrofóbicas expuestas en la cabeza de uno y la cola hidrofóbica de otro, lo que lleva a la agregación y formación de gel de coagulina turbio insoluble. La turbidez medida ayuda a determinar la concentración de endotoxinas en la nanoformulación.
La recuperación de pico calculada a partir de las concentraciones de endotoxinas en las muestras de prueba y enriquecidas dentro del rango aceptable indica que no hay interferencia importante de la nanoformulación, lo que valida la presencia de endotoxinas en el fármaco nanoformulado.
Para la preparación del patrón de calibración, utilice 900 microlitros de lisado de amebocitos de Limulus o agua de grado LAL, y 100 microlitros de endotoxina estándar de control, para preparar tantas diluciones intermedias como sea necesario, para permitir la preparación de un patrón de calibración con una concentración de una unidad de endotoxina por mililitro.
Luego, usando 900 microlitros de agua de grado LAL y 100 microlitros del estándar de calibración de una unidad de endotoxina por mililitro, prepare un segundo estándar de calibración a una concentración de 0.1 unidad de endotoxina por mililitro.
Luego, repita la dilución en serie de 10 veces para preparar dos estándares de calibración más bajos, para obtener un total de cuatro estándares de calibración que van desde 0.001 a 1 unidad de endotoxina por mililitro.
Para preparar un control de calidad de 0,05 unidades de endotoxinas por mililitro, combine 50 microlitros de una unidad de endotoxina por mililitro de solución de endotoxinas estándar de control con 950 microlitros de agua de grado LAL.
A continuación, en el software, seleccione 'Configuración del instrumento' y cree la plantilla. Seleccione 'Recopilar datos' e ingrese el ID de prueba y el grupo de datos en la pestaña 'General'. En la pestaña 'Hardware', seleccione el tipo de instrumento y el método LAL, y verifique que aparezca un número de serie, el ID del sistema y la información del puerto serie en la pantalla.
Haga clic en "Aceptar" dos veces para confirmar la selección del instrumento y la comunicación con el instrumento, e introduzca los ID de las muestras en el mismo orden en que se probarán las muestras. Luego, use los botones predeterminados para ingresar el control negativo, la curva estándar y las muestras de prueba.
Agregue el volumen apropiado de estándares de calibración de control negativo y control de calidad en tubos de vidrio duplicados preetiquetados, y agregue el volumen apropiado de LAL al primer vial de prueba. Agite el vial brevemente y colóquelo en las ranuras de prueba apropiadas en el carrusel de instrumentos.
Antes de cargar las muestras, realice varias diluciones del nanomaterial de prueba dentro de la dilución máxima válida demostrada.