Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 2:57 min. • July 8th, 2025
La membrana externa de las bacterias Gram-negativas contiene endotoxinas llamadas lipopolisacáridos o LPS. El LPS tiene una porción de oligosacárido hidrófilo y una región de lípidos A hidrofóbicos.
Una vez dentro del huésped, las proteínas de unión a LPS reconocen las endotoxinas. Estas proteínas luego se unen a los receptores en las células inmunes circulatorias. Esta unión activa las células inmunitarias, que liberan factores inflamatorios. La sobreproducción de estos factores exagera la respuesta inmune, causando la muerte celular.
Para detectar endotoxinas utilizando el lisado de amebocitos de Limulus, o ensayo LAL, tome una formulación que contenga endotoxinas unidas a la superficie lipofílica de las nanopartículas a través de sus porciones hidrofóbicas de lípido A.
Agregue el reactivo LAL al tubo. Este reactivo es un lisado acuoso que contiene enzimas y proteínas inactivas derivadas de los amebocitos, células sanguíneas del cangrejo herradura.
Incubar el tubo para facilitar la unión de endotoxinas a la proenzima proenzima del factor de coagulación C inactivo derivado del lisado, activándola autocatalíticamente.
El factor C activado escinde otra proenzima, el factor B, formando una proteasa que escinde una enzima procoagulante y la convierte en una forma activa: la enzima de coagulación limulus. Esta enzima escinde el coagulógeno, una proteína de coagulación inactiva, en coagulina.
Los monómeros de coagulina se unen a través de sus colas hidrofóbicas a las cabezas hidrofóbicas de otros monómeros de coagulina. Esta autopolimerización da como resultado la formación de un homopolímero que aparece como un coágulo gelatinoso en la base del tubo. Invierta el tubo suavemente.
Un coágulo firme que permanece en el fondo del tubo confirma la presencia de endotoxinas.
Para realizar un LAL de coágulo de gel, prepare la endotoxina estándar de control a una concentración final de 4 lambda y combine 100 microlitros de estándar con 100 microlitros de agua, o una muestra de prueba, para lograr una concentración final de endotoxina estándar de control 2 lambda.
Agregue 100 microlitros de lisado a cada dilución lambda. Agite los tubos brevemente y coloque la rejilla de tubos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 1 hora.
Al final de la incubación, invierta los tubos con un movimiento suave y registre manualmente los resultados usando más para un coágulo firme y menos para ningún coágulo o un coágulo suelto.