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Las enzimas que degradan los carbohidratos descomponen los polisacáridos complejos en oligosacáridos más pequeños.
Para detectar la actividad de degradación de la enzima, comience tomando múltiples hidrogeles de polímeros cromogénicos, CPH, que se preparan teñiendo polisacáridos con colorantes de clorotriazina de diferentes colores. Luego, cada polisacárido se reticula químicamente para formar hidrogel, un sustrato sintético para la degradación enzimática.
Ahora, dispense diferentes sustratos de CPH en distintos pocillos de una placa de reacción porosa. Agregue una solución de activación e incube para garantizar una activación óptima de los sustratos.
Coloque la placa de ensayo sobre una placa de producto vacía. Centrifugar las placas juntas a baja velocidad para facilitar la eliminación eficiente de la solución de activación a través de los poros de la placa de reacción.
A continuación, complemente todos los pocillos de la placa de reacción con el mismo tipo de enzima degradadora de carbohidratos en un tampón adecuado que mantenga un pH óptimo para la actividad enzimática. Selle la placa e incube con agitación suave para permitir una distribución uniforme de las enzimas en la red polimérica, permitiéndoles acceder al sustrato.
Durante la incubación, la enzima, con una actividad adecuada contra el sustrato, degrada los polisacáridos en CPH para producir oligosacáridos ligados a colorantes más pequeños. Estos productos son solubles, lo que hace que la solución sea coloreada. Gire las placas para recoger la solución coloreada en la placa del producto.
Espectrofotométricamente, determine la absorbancia del producto para medir la actividad enzimática.
Para comenzar, active la placa del kit de ensayo de filtro de 96 pocillos agregando 200 microlitros de solución de activación a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente sin agitar durante 10 minutos.
Use una centrífuga y cualquier placa estándar de 96 pocillos para la recolección para reducir la solución de activación existente. Agregue 100 microlitros de agua estéril al hidrogel de polímero cromogénico, o sustratos de CPH, y aplique una aspiradora o centrifugado para eliminar el estabilizador. Repita el lavado dos veces más.
Para preparar la reacción enzimática, agregue 150 microlitros de tampón de acetato de sodio de 100 milimolares pH 4.5 y 5 microlitros de solución de endocelulasa con tres concentraciones diferentes, a cada pocillo de la placa del kit de ensayo.
Coloque la placa del producto debajo de la placa del kit de ensayo para recoger cualquier fuga potencial de la placa de reacción durante la agitación. Luego, incube la placa del kit de ensayo a temperatura ambiente en un agitador horizontal a 100 RPM durante 30 minutos.
Para recibir datos fiables, es necesario agitar la mezcla de reacción durante la incubación.
Coloque la placa del kit de ensayo con la placa del producto debajo de ella en la centrífuga y gírela a 2.700 x g durante 10 minutos, para transferir el producto de reacción a los pocillos de la placa del producto.
Después del giro, inspeccione visualmente la placa del producto para verificar que el volumen de líquido en cada pocillo sea aproximadamente el mismo. Usando un lector de placas, lea la absorbancia de la placa de recolección a 630 nanómetros para los diferentes sustratos de CPH verde.