Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:27 min. • July 8th, 2025
La biomasa es una materia orgánica derivada de plantas compuesta principalmente por polisacáridos complejos. Las enzimas degradadoras de carbohidratos actúan sobre estos polisacáridos para producir oligosacáridos más pequeños.
Para evaluar la actividad de degradación de una enzima, comience tomando diferentes sustratos de biomasa cromogénica insoluble: ICB presentes en los pocillos de una placa de reacción porosa. Estos sustratos se obtienen a partir del teñido de materiales derivados de plantas con un colorante de clorotriazina de color específico. La biomasa resultante tiene polisacáridos complejos marcados con colorante que sirven como sustrato para la actividad enzimática.
Ahora, agregue una solución tampón que contenga una enzima hidrolizadora de carbohidratos. El tampón mantiene el pH para una actividad enzimática óptima. Coloque la placa de reacción en un agitador e incube. La agitación constante permite que las moléculas de la enzima alcancen el polisacárido objetivo en el sustrato ICB.
Durante la incubación, la enzima hidrolizadora escinde los enlaces glucosídicos covalentes dentro de los polisacáridos de cadena larga. La reacción produce oligosacáridos solubles unidos a moléculas de colorante, que permanecen en la solución.
Una vez completada la degradación, coloque la placa de reacción encima de una placa de producto y centrifugue el conjunto. Durante la centrifugación, la solución coloreada que contiene productos de reacción, pasa a través del filtro en la parte inferior de la placa y se recoge en la placa del producto. Usando un lector de placas, registre la absorbancia del sobrenadante.
Un valor de absorbancia más alto denota la generación de una gran cantidad de oligosacáridos ligados a colorantes, lo que indica la eficiencia de la enzima en la degradación del sustrato ICB.
Para realizar el ensayo cromogénico con Biomasa Cromogénica Insoluble roja, o paja de trigo ICB, se debe comenzar agregando 200 microlitros de solución de activación a cada pocillo de la placa de ensayo. Luego, incube la placa a temperatura ambiente, sin agitar durante 10 minutos.
Retire el estabilizador usando 100 microlitros de agua estéril para lavar los pocillos tres veces. Luego, agregue 150 microlitros de tampón de acetato de sodio de 100 milimolares, pH 4.5 y 5 microlitros de 10 unidades por mililitro de solución de endoxilanasa diferente.
Coloque la placa del producto debajo de la placa de sustrato para recoger cualquier fuga potencial de la placa de sustrato durante la agitación e incube la reacción a temperatura ambiente y 100 RPM durante 2 horas.
Después de la incubación, coloque la placa del kit de ensayo, con la placa del producto debajo, en la centrífuga, y gire hacia abajo a 2.700 x g durante 10 minutos para transferir el producto de reacción a los pocillos de la placa del producto.
Verifique que el volumen de líquido en cada pocillo sea aproximadamente el mismo. Luego, usando un lector de placas, lea la absorbancia de la placa de recolección a 517 nanómetros para la paja de trigo ICB roja.