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Técnicas biológicas
0 vistas • 4:31 min • July 8th, 2025
Los mitocanos son una clase de medicamentos que afectan selectivamente el funcionamiento de las mitocondrias en las células cancerosas e inducen la apoptosis.
Para determinar la citotoxicidad de mitocan, siembre una suspensión celular que contenga células cancerosas semiadherentes en una placa de pocillos múltiples. Trate la placa con la solución mitocan deseada e incube.
Mitocan ingresa a la célula cancerosa para interrumpir su actividad mitocondrial, lo que eventualmente conduce a la muerte celular en las células cancerosas sensibles a mitocan. Trate las células con una solución de tinción que contenga una mezcla de colorante Hoechst y yoduro de propidio.
Hoechst, un tinte fluorescente permeable a la membrana, penetra en todas las células y se une a la región rica en AT de su ADN, impartiendo una fluorescencia azul a los núcleos de las células vivas y muertas.
Por el contrario, el yoduro de propidio, un tinte fluorescente impermeable a la membrana, ingresa exclusivamente a las células muertas a través de las partes dañadas de sus membranas. El tinte se intercala entre las bases de ADN, impartiendo una fluorescencia roja adicional a las células muertas. La presencia de ambos colorantes en los núcleos de estas células hace que las células muertas parezcan moradas.
Centrifugue la placa a baja velocidad para asentar las células para mejorar la precisión durante la obtención de imágenes. Tome imágenes bajo un microscopio de fluorescencia y observe dos poblaciones celulares distintas. Cuente el número de ambos tipos de células.
El porcentaje de células moradas que representan la población muerta en comparación con la población total indica el potencial citotóxico del mitocán de prueba.
Comience preparando soluciones de los compuestos de interés a la concentración deseada. Siempre asegúrese de mezclar compuestos mediante vórtices completos.
Para medir la citotoxicidad de un solo compuesto, prepare compuestos a una concentración final 2X. Si mide la citotoxicidad de combinaciones de compuestos, prepárelas a una concentración final 4X.
Prepare controles de solo solvente mezclando la misma cantidad de solvente con el medio apropiado. Recoja las células en un tubo cónico de 15 mililitros y alícuotas de 10 microlitros de la suspensión celular para la tinción con azul de tripano. Agregue 10 microlitros de azul de tripano al 0,4% a la alícuota y use un hemocitómetro o contador de células para contar células viables y no viables.
Granular las células en el tubo de 15 mililitros a 200 x g durante 5 minutos, luego, aspirar o decantar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en un medio apropiado para el ensayo a una densidad celular de 3x105 células por mililitro. Utilice una pipeta multicanal para sembrar 50 microlitros de suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
Para ensayos de un solo compuesto, agregue 50 microlitros de solución compuesta 2X en cada pocillo. Para pocillos de control de disolventes, agregue 50 microlitros de medios de prueba que contengan el disolvente a una concentración de 2X. Para ensayos combinados, agregue 25 microlitros de cada uno de los compuestos 4X en cada pocillo. Para pocillos de control de un solo compuesto, agregue 25 microlitros de cada uno de la solución compuesta 4X y el medio de prueba. Asegúrese de que la concentración final de DMSO no exceda el 0,5%.
Para garantizar la reproducibilidad, agregue medicamentos con la punta de la pipeta tocando el costado de los pocillos, teniendo cuidado de agregar los medicamentos a diferentes ubicaciones. Este paso debe realizarse muy rápidamente, preferiblemente no tomando más de 30 minutos por plato.
Golpee suavemente la placa para mezclar el contenido de los pocillos e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Cuando esté listo para teñir las células con Hoechst 33342 y yoduro de propidio, prepare una solución de tinción 10X fresca y agregue 10 microlitros a cada pocillo. Golpee suavemente el plato e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos.
Centrifugar la placa a 200 x g durante 4 minutos para llevar todas las células al fondo de la placa. Luego, limpie cuidadosamente la parte inferior de la placa con una toallita de laboratorio húmeda para eliminar cualquier residuo que pueda interferir con las imágenes. Imagen de la placa dentro de los 15 minutos posteriores a la centrifugación.