Ensayo de unión a anexina V: una técnica basada en fluorescencia para identificar eritrocitos apoptóticos mediante el marcaje con fosfatidilserina

Durante ciertas condiciones patológicas, los eritrocitos o glóbulos rojos experimentan una contracción celular acompañada de la translocación del fosfolípido de membrana - fosfatidilserina - de la valva de la membrana interna a la externa, lo que lleva a la muerte celular programada, eriptosis, desencadenando la fagocitosis celular mediada por macrófagos.

Para medir la eriptosis inducida por ionóforos en una población aislada de eritrocitos humanos mediante un ensayo de unión a la anexina V, comience con eritrocitos suspendidos en un tampón libre de glucosa.

El agotamiento de la glucosa induce estrés celular, activando la proteína quinasa C citosólica, que posteriormente activa los canales de calcio y provoca la afluencia de iones de calcio. Además, los canales de potasio se activan, lo que provoca la salida de potasio y la contracción celular.

A continuación, agregue ionóforo de calcio que forma un complejo estable con iones de calcio extracelulares. El complejo facilita la entrada citosólica de iones de calcio a través de la membrana celular, aumentando aún más la concentración de calcio intracelular. Esto, a su vez, activa la escramblasa, un transportador bidireccional de fosfolípidos, que ayuda en la translocación de la fosfatidilserina de la valva de la membrana celular interna a la externa, reduciendo la asimetría de la membrana e induciendo eriptosis.

Centrifugar los eritrocitos tratados con ionóforos. Vuelva a suspender las células en un tampón de unión que contenga calcio. Agregue una solución de anexina V conjugada con colorante fluorescente.

La proteína de unión a fosfolípidos dependiente de calcio, la anexina V, que tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina, se une a los residuos de fosfatidilserina expuestos en la valva de la membrana celular externa.

Usando la clasificación de células activadas por fluorescencia, separe la población de eritrocitos en función de la intensidad de fluorescencia de la anexina V. Los eritrocitos erittóticos exhiben una mayor intensidad de fluorescencia de anexina V que los eritrocitos sanos.

Diluya 2 mililitros del tampón de unión de anexina V 5X en 8 mililitros de PBS para obtener un tampón de unión 1X. Vuelva a suspender los gránulos celulares tratados con ionomicina y no tratados en 1 mililitro del tampón de unión 1X.

Tome 235 microlitros de las suspensiones celulares en el tampón de unión y agregue 15 microlitros de conjugado de anexina V-Alexa Fluor 488 en un tubo de microcentrífuga. Incube las células a temperatura ambiente durante 20 minutos en un lugar oscuro.

Centrifugar a 700 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante. Lave las células dos veces con tampón de unión 1X suspendiendo el gránulo de células en 1,5 mililitros del tampón de unión y centrifugando a 700 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 250 microlitros de tampón de unión 1X para mediciones de citometría de flujo. Ahora, transfiera 200 microlitros de eritrocitos teñidos con anexina V a tubos de poliestireno de fondo redondo de 1 mililitro compatibles con citometría de flujo.

Inicie sesión en el software de citometría de flujo y haga clic en el botón 'Nuevo experimento'. Haga clic en el botón 'Nuevo tubo', seleccione la 'Hoja global' y elija 'Aplicar análisis' para medir la intensidad de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 530 nanómetros.

Establezca el número de células en 20,000 para recolectar para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia. Seleccione el tubo deseado y haga clic en el botón 'Cargar'. Haga clic en el botón 'Grabar' para obtener mediciones de dispersión hacia adelante y dispersión lateral. Repita para todas las muestras.

Haga clic con el botón derecho en el botón 'Muestra' y haga clic en 'Aplicar análisis por lotes' para generar el archivo de resultados. Haga clic con el botón derecho en el botón 'Muestra' y haga clic en 'Generar archivos FSC'.