Ensayo de depleción de glucosa in vitro: un método basado en fluorescencia para cuantificar la absorción de glucosa celular a través de la medición de la depleción de glucosa extracelular

La glucosa, una fuente primaria de energía celular, ingresa a las células a través de las proteínas transportadoras de glucosa de la membrana celular. La glucosa se descompone en el citoplasma celular en piruvato, a través de la vía glucolítica, generando energía a través del trifosfato de adenosina, o ATP, para el metabolismo celular.

Para medir la absorción intracelular de glucosa, comience con un cultivo adherente de fibroblastos en una placa de pocillos múltiples. Reemplace el medio con medios sin glucosa e incube. Las células metabolizan la glucosa disponible para producir energía, alcanzando un estado de falta de glucosa.

Reemplace el medio en un conjunto de pocillos con medios sin glucosa que contengan insulina, un estimulador de la captación de glucosa y desoxiglucosa fluorescente, un análogo de la glucosa. Trate otro conjunto de pocillos con medios sin glucosa que contengan desoxiglucosa fluorescente.

Durante la incubación, la insulina estimula la translocación de transportadores de glucosa adicionales a la membrana plasmática, lo que facilita una mayor captación de desoxiglucosa fluorescente, en ausencia de glucosa.

La desoxiglucosa es fosforilada y no metabolizada por las células. Al mismo tiempo, la concentración extracelular de desoxiglucosa fluorescente disminuye.

Después de la incubación, recoja los medios que contienen desoxiglucosa fluorescente no utilizada. Trate las células con un tampón de lisis. El detergente en el tampón forma micelas y solubiliza las membranas celulares, provocando la liberación de contenido intracelular.

Usando un lector de microplacas, mida la fluorescencia del homogeneizado celular que contiene desoxiglucosa fluorescente intracelular y medios que contienen desoxiglucosa fluorescente extracelular no utilizada.

Los fibroblastos estimulados por insulina exhiben un aumento de la captación de desoxiglucosa fluorescente intracelular y la correspondiente disminución de la desoxiglucosa fluorescente extracelular en comparación con las células no estimuladas.

Utilice 8 réplicas para cada condición de simulación. Por lo tanto, prepare 1 mililitro para cada condición de simulación.

Utilice 7 condiciones de simulación sin insulina: FD-glucosa de 2,5 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 0,5 microgramos por mililitro, 0,2 microgramos por mililitro, 0,1 microgramos por mililitro, 0,05 microgramos por mililitro y 0 miligramos por mililitro en una placa de 96 pocillos.

Use 7 condiciones de estimulación con insulina: FD-glucosa de 2.5 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 0.5 microgramos por mililitro, 0.2 microgramos por mililitro, 0.1 microgramos por mililitro, 0.05 microgramos por mililitro y 0 microgramos por mililitro en otra placa de 96 pocillos.

Para preparar las condiciones de estimulación, diluya 1 microlitro de 5 miligramos por mililitro de solución de trabajo de FD-glucosa y 999 microlitros de DMEM sin glucosa para obtener 1 mililitro de solución de material de trabajo.

Usando esta solución de material de trabajo, prepare diluciones 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 y 1:100,000 de FD-glucosa para obtener 2.5 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 0.5 microgramos por mililitro, 0.2 microgramos por mililitro, 0.1 microgramos por mililitro, 0.05 microgramos por mililitro en tubos de 2 mililitros inmediatamente antes de los experimentos en un gabinete de bioseguridad sin luces. Agregue 1 microlitro de insulina a cada una de estas afecciones.

Después de 40 minutos de incubación, decantar el DMEM sin glucosa de cada pocillo en placas de 96 pocillos y absorber el líquido restante con toallas de papel estériles. Agregue 100 microlitros de cada una de las diversas condiciones de tratamiento descritas anteriormente, a los pocillos a lo largo de una columna, y 100 microlitros de la misma condición de tratamiento a los pocillos a lo largo de la fila en ambas placas de 96 pocillos. Etiquete las placas que utilizaron las condiciones con y sin insulina.

Agregue DMEM sin glucosa solo a los pocillos de control. Incube la placa durante 40 minutos en una incubadora de cultivo celular en la oscuridad.

Después de que las células hayan sido estimuladas durante 40 minutos, transfiera los medios de estimulación de ambas placas a nuevas placas de 96 pocillos, manteniendo el mismo diseño experimental. Lave las células con PBS. Retire el PBS y decante cualquier solución restante sobre toallas de papel estériles.

Agregue un inhibidor de la proteasa al tampón del ensayo de radioinmunoprecipitación para proteger las proteínas. Coloque las placas que contienen el ensayo de radioinmunoprecipitación en un agitador durante 30 minutos.

Usando un lector de microplacas, mida la fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nanómetros respectivamente, primero, en el medio que contiene FD-glucosa extracelular, y luego, la placa con células lisadas por ensayo de radioinmunoprecipitación al final de 30 minutos de incubación.