Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:04 min. • July 8th, 2025
En los tejidos, la glucosa extracelular ingresa a las células a través de una difusión facilitada a través de transportadores de glucosa específicos.
La glucosa se descompone en piruvato en el citoplasma celular a través de la glucólisis, una vía metabólica, que genera energía en forma de trifosfato de adenosina, o ATP, para los procesos metabólicos celulares.
Para medir la absorción de glucosa ex vivo, comience con tejido hepático de ratón de tamaño pequeño recién cosechado. Agregue un tampón adecuado para mantener las condiciones fisiológicas.
A continuación, transfiera el tejido a una placa de pocillos múltiples que contenga medios libres de glucosa. Siga la incubación en medios sin glucosa suplementados con desoxiglucosa, un análogo de glucosa marcado con fluorescencia. El pequeño tamaño del tejido permite la entrada de desoxiglucosa.
La desoxiglucosa ingresa a las células a través de transportadores de glucosa, en ausencia de glucosa. Dentro de las células, la desoxiglucosa sufre fosforilación pero no se metaboliza más, lo que lleva a su acumulación.
Recoja los medios que contienen desoxiglucosa marcada con fluorescencia no utilizada en los puntos de tiempo deseados. Usando un lector de microplacas, mida la fluorescencia de la desoxiglucosa extracelular, que se puede correlacionar con la absorción de desoxiglucosa en el tejido intracelular.
Incube los tejidos u órganos extraídos en una placa de 6 pocillos que contenga PBS durante un minuto. Manipule cada tejido u órgano en un pozo separado. Después de un minuto, coloque cada pañuelo sobre una toalla de papel estéril para absorber el PBS.
Transfiera tejidos u órganos en una placa separada de 6 pocillos que contenga 4,000 microlitros de DMEM sin glucosa e incube durante dos minutos. Después de dos minutos, retire y transfiera los tejidos a los pocillos de una placa de 6 pocillos que contenga una solución de trabajo de glucosa FD de 0,29 milimolares. Incube las placas de 6 pocillos que contienen tejidos en una solución de trabajo de FD-glucosa a 37 grados Celsius.
Recoja 100 microlitros de solución de trabajo de FD-glucosa de cada pocillo después de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 minutos de incubación, y transfiera los 100 microlitros recolectados de solución de trabajo de FD-glucosa a placas de 96 pocillos para analizar la cinética del agotamiento extracelular de FD-glucosa. Agitar antes y después de la recolección.
Mida la fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nanómetros respectivamente utilizando un lector de microplacas.