Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:45 min. • July 8th, 2025
La pared de la aorta tiene predominantemente células de músculo liso, o SMC, que contienen maquinaria de proteínas contráctiles que se contraen y relajan para regular el flujo sanguíneo aórtico.
Para medir la respuesta contráctil de las SMC aórticas in vitro, obtenga una placa de pocillos múltiples que contenga una matriz de sensores de detección de impedancia de sustrato de célula eléctrica, o ECIS. Cada matriz contiene electrodos de película de oro en el fondo del pozo, delineados con una película aislante. Cubra los pozos con gelatina.
Siembre la suspensión primaria de SMC humana en los pozos. Transfiera la placa de pocillos que contiene ECIS a un soporte de placa conectado a un amplificador y sistema de adquisición de datos mientras garantiza el contacto del electrodo con el soporte. Aplique una pequeña corriente alterna constante entre los electrodos para medir el potencial a través de ellos.
Durante la incubación, los SMC se adhieren y se extienden sobre el recubrimiento de gelatina. Las celdas se comportan como aislantes, limitando el flujo de corriente entre los electrodos. A medida que más celdas se adhieren a la superficie, el flujo de corriente disminuye aún más. Como resultado, la impedancia u oposición al flujo de corriente y el aumento potencial. Eventualmente, las células proliferan en los electrodos y forman una monocapa.
Trate las SMC con un ionóforo de calcio para facilitar el transporte de iones de calcio a través de las membranas celulares. La entrada de iones de calcio extracelulares activa el aparato contráctil, induciendo la contracción.
Las SMC estimuladas se contraen y pierden el contacto célula-célula en los electrodos. La reducción resultante en la cobertura de la superficie del electrodo disminuye la impedancia, lo que facilita la cuantificación en tiempo real de la contracción de SMC.
Cuente las células utilizando un contador de células automatizado y siembre las SMC por triplicado a una densidad de siembra de 30,000 células por pocillo, en 200 microlitros de medio SMC en la placa ECIS recubierta de gelatina. Coloque la placa con los SMC en el soporte ECIS de 96 pocillos en la incubadora de cultivos celulares.
Haga doble clic en el "software ECIS Applied Biophysics" para abrir el programa y presione el botón "Configuración". Compruebe si todos los electrodos tienen contacto con el soporte, en el panel inferior izquierdo con la etiqueta "Configuración de pozos". Si los electrodos no están conectados correctamente, ajuste la placa en el soporte antes de comenzar la medición.
Ahora, seleccione el tipo de placa en el mismo panel haciendo clic en "Tipo de matriz". A continuación, prepare dos pipetas ajustadas a un volumen de 2 microlitros y 150 microlitros. Antes de iniciar la estimulación, presione "Marcar" en el software y coloque un comentario.
Para estimular las células, retire la tapa y colóquela sobre una superficie estéril dentro de la incubadora. A continuación, induzca la contracción de SMC pipeteando 2 microlitros de la solución de trabajo de ionomicina en cada pocillo lo más rápido posible.
Una vez que se hayan estimulado todas las células, mezcle el medio en los pocillos con la segunda pipeta.