El ensayo de filamento de actina deslizante: un ensayo de motilidad in vitro para estudiar la translocación de filamentos de actina en miosinas inmovilizadas
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 6:01 min. • July 8th, 2025
La miosina, una proteína motora, interactúa con otra proteína filamentosa, la actina, provocando su translocación.
Para analizar el movimiento de deslizamiento de la actina, ensamble una cámara de flujo basada en portaobjetos de vidrio de modo que la parte interna de la parte superior de la cámara esté recubierta de nitrocelulosa. Fluye en las proteínas de miosina a través de la cámara, que se inmovilizan sobre la capa de nitrocelulosa.
Complemente la cámara con filamentos de actina sin marcar (actinas negras) y agregue un tampón de motilidad que contenga trifosfato de adenosina o moléculas de ATP.
Los filamentos de actina se unen a las miosinas activas inmovilizadas junto con las miosinas inactivas o muertas. Las moléculas de ATP interactúan con las miosinas activas, lo que lleva a su disociación de las actinas negras, mientras que las miosinas inactivas permanecen unidas a la actina.
Centrífuga para peletizar miosinas inactivas unidas a actinas negras. Enjuague bien con un tampón para eliminar el gránulo de miosina inactivo, los filamentos de actina libre y los ATP no utilizados. Flujo en actinas marcadas con fluorescencia que se unen a miosinas activas inmovilizadas.
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