JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:39 min • July 8th, 2025
La miosina, una proteína motora, tiene un dominio de cabeza globular que interactúa con la actina, una proteína filamentosa. Esta interacción es esencial para la translocación de miosina a lo largo de los filamentos de actina. Para estudiar esta unión in vitro, realice un ensayo de motilidad invertida de miosina sobre actina atada a la superficie.
Para comenzar, ensamble una cámara de ensayo colocando un cubreobjetos recubierto de polietilenglicol biotinilado - PEG sobre un portaobjetos de microscopio de modo que la superficie recubierta mire hacia el interior, creando la parte superior de la cámara.
Pase una solución que contenga avidina, una glicoproteína, a través de la cámara. La avidina se une a la biotina con alta afinidad, lo que mejora la adhesión de la actina. A continuación, fluya en filamentos de actina marcados con biotina marcados con un fluoróforo rojo. El ligando de biotina se une a la avidina, inmovilizando los filamentos en la superficie del cubreobjetos.
Finalmente, agregue proteínas de miosina 5A marcadas con proteína verde fluorescente en un tampón que contenga moléculas de trifosfato de adenosina o ATP. La miosina 5A de doble cabeza, que contiene una cabeza de arrastre y una cabeza delantera, interactúa con los filamentos de actina inmovilizados. La cabeza posterior de la miosina se une a un ATP y se separa de la actina.
La hidrólisis del ATP genera un golpe de potencia, lo que permite que la cabeza de arrastre se una a una posición por delante de la cabeza de cabeza a lo largo del filamento. A través de sucesivos golpes de potencia, la miosina se mueve a lo largo del filamento de actina inmovilizado sin desprenderse.
Usando microscopía de fluorescencia, registre el movimiento de las moléculas de miosina verde en los filamentos de actina roja.
Prepare las soluciones para el ensayo de motilidad invertida de miosina 5a y manténgalas en hielo.
Lave la cámara con 10 microlitros de tampón de motilidad con DTT. Flujo en 10 microlitros de 1 miligramo por mililitro BSA en tampón de motilidad con DTT. Repita esto dos veces, esperando un minuto después del tercer lavado. Use papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal colocando suavemente la esquina del papel en la salida de la cámara de flujo.
Luego, lave la cámara con 10 microlitros de tampón de motilidad con DTT tres veces. Fluya en 10 microlitros de la solución de NeutrAvidin en tampón de motilidad con DTT y espere un minuto. Luego, lava con 10 microlitros de esa solución tres veces.
Fluya en 10 microlitros de tampón de motilidad que contiene bRh-actina con DTT utilizando una punta de pipeta de gran diámetro y espere un minuto. Luego, lavar con 10 microlitros de tampón de motilidad con DTT tres veces.
Fluya en 30 microlitros de tampón final con 10 miosina 5a nanomolar y cargue inmediatamente en el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total. Comience a grabar una vez que se encuentre el enfoque óptimo para las imágenes TIRF.