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Técnicas biológicas
0 vistas • 3:29 min • July 8th, 2025
Las células intestinales producen especies reactivas de oxígeno: ROS. Los niveles moderados de ROS mantienen la homeostasis celular, mientras que los niveles altos de ROS pueden causar la muerte celular.
Para cuantificar los niveles de ROS in vitro, comience con un cultivo de organoides intestinales 3D de ratón. Estos organoides exhiben una arquitectura de epitelio intestinal con protuberancias en forma de cripta que albergan células madre que expresan fluorescencia verde. También contienen células diferenciadas similares a vellosidades en la periferia, que rodean la luz central que comprende células muertas y desechos. Todas estas células producen diferentes niveles de ROS.
Ahora, trate los organoides en los pocillos designados con moduladores ROS. Según su naturaleza, los moduladores pueden actuar como inductores o inhibidores de ROS. Después de incubar durante el tiempo requerido, retire el medio gastado.
Agregue una enzima proteolítica al cultivo, interrumpiendo la arquitectura 3D de los organoides y liberando diferentes células en suspensión. A continuación, agregue una sonda fluorogénica sensible a ROS e incube.
Al ingresar a las células, las sondas reaccionan con ROS y se oxidan para producir fluorescencia roja. Trate las células con DAPI, un tinte fluorescente que se une al ADN, que tiñe selectivamente los núcleos de las células muertas, creando un contraste con las células vivas.
Usando un citómetro de flujo, analice las células vivas negativas para DAPI para obtener una señal de fluorescencia roja correspondiente a su nivel de ROS. Dependiendo de la naturaleza de los moduladores, los inductores aumentan los niveles de ROS mientras que los inhibidores los disminuyen.
Agregue 1 microlitro de la solución madre de N-acetilcisteína en los pocillos de control negativo de la placa de fondo redondo de 96 pocillos que contiene los organoides.
Después de una incubación de 1 hora, agregue 1 microlitro de solución madre de hidroperóxido de terc-butilo en los pocillos correspondientes e incube durante 30 minutos. A continuación, con una pipeta multicanal, retire el medio sin alterar el BMM adjunto y transfiéralo a otra placa de fondo redondo de 96 pocillos. Deja este plato a un lado.
A continuación, agregue 100 microlitros de tripsina y, con una pipeta multicanal, pipetee hacia arriba y hacia abajo cinco veces para destruir el BMM. Después de una breve incubación de 5 minutos, disocie los organoides pipeteando hacia arriba y hacia abajo por segunda vez.
Gire la placa y deseche el sobrenadante invirtiendo la placa. Agregue el medio previamente recolectado en otra placa de 96 pocillos, nuevamente en los pocillos correspondientes y vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces.
A continuación, agregue 1 microlitro de la sonda fluorogénica e incube durante 30 minutos. Luego, gire la placa nuevamente y vuelva a suspender las celdas con 250 microlitros de solución DAPI. Transfiera las muestras en tubos de citometría de flujo y mantenga los tubos en hielo.
Optimice los ajustes de voltaje de dispersión directa y lateral en voltajes de control y láser sin teñir, para cada fluoróforo utilizando muestras monoteñidas. Luego, utilizando una estrategia de cierre adecuada, recopile un mínimo de 20,000 eventos.