Ensayo de SUMOilación: una técnica in vitro para detectar el estado de SUMOilación de proteínas sustrato mediante inmunotransferencia

La SUMOilación ocurre debido a la unión de pequeños modificadores similares a la ubiquitina, SUMO, a las proteínas sustrato.

La sumoilación ocurre cuando un péptido SUMO maduro es activado por una enzima - E1. Tras la activación, el SUMO se transfiere al sitio activo de la enzima conjugadora, E2, uniendo el SUMO al residuo de lisina de la proteína sustrato. Otra ligasa, E3, mejora la eficiencia de esta interacción.

Para realizar un ensayo de SUMOilación in vitro, comience con un tubo que contenga una mezcla de la proteína sustrato - p53, enzimas y péptidos SUMO, e incube para inducir la SUMOilación. Complemente el tubo con dodecil sulfato de sodio, tampón que contiene SDS, terminando la reacción. Caliente la muestra para desnaturalizar las proteínas.

Cargue la mezcla de proteínas en el pocillo de un gel SDS-PAGE y realice una electroforesis. Las proteínas SUMOiladas de mayor peso molecular se mueven más lentamente que sus variantes no SUMOiladas, generando dos bandas distintas.

Transfiera el gel a una membrana secante presente en un papel de filtro húmedo en un aparato de electrotransferencia. Cubra con un papel de filtro húmedo y transfiera eléctricamente las proteínas del gel a la membrana.

Trate la membrana con anticuerpos anti-p53, que se unen a p53. Superposición con anticuerpos secundarios conjugados con enzimas que se unen a complejos anticuerpo-p53. Agregue un sustrato quimioluminiscente para generar un producto luminiscente y obtener imágenes de la membrana.

Una banda de mayor peso molecular corresponde a las proteínas SUMOiladas, mientras que la banda inferior corresponde a las variantes de proteínas no SUMOiladas.

Agregue 3 microlitros de 100 nanogramos por microlitro de tag-K-bZIP purificado en la reacción de mezcla maestra de SUMOilación in vitro. Luego, mezcle suavemente el contenido de la mezcla maestra e incube a 30 grados centígrados durante 3 horas.

A continuación, agregue 20 microlitros de 2x SDS-PAGE con tampón de carga para detener la reacción. Luego, caliente las muestras a 95 grados centígrados durante 5 minutos para desnaturalizar la proteína.

A continuación, cargue 20 microlitros de la muestra en un gel SDS-PAGE al 10% y haga funcionar el gel a 80 voltios durante unos 120 minutos hasta que el tinte llegue al fondo del gel.

Una vez finalizada la electroforesis, desconecte el aparato de gel y transfiera el gel en un tampón de transferencia semiseco durante 5 minutos. Luego, remoje la membrana de PVDF en otro recipiente lleno de metanol durante 1 minuto.

Retire la membrana de PVDF del metanol y sumérjala en un tampón de transferencia semiseco. Luego, agite suavemente la membrana durante 5 minutos.

Retire la cubierta de seguridad del aparato electroforético semiseco. Humedezca previamente un papel de filtro y prepare un sándwich de gel en la parte inferior del ánodo de platino. Después de asegurar la placa catódica en la cubierta de seguridad, haga funcionar la transferencia a 15 voltios de corriente constante durante 90 minutos. Luego, apague la fuente de alimentación y saque la membrana de PVDF, después de desconectar el aparato semiseco.

Ahora, bloquee la membrana de PVDF con tampón de bloqueo, durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a 30 revoluciones por minuto. A continuación, hibride la membrana de PVDF con el anticuerpo anti-p53 y el tampón de bloqueo durante 12 a 16 horas a 4 grados centígrados, en un mezclador de suspensión a 30 revoluciones por minuto.

Luego, saque la membrana de PVDF y transfiérala a un recipiente lleno de solución salina tamponada con TRIS con Tween-20. A continuación, sumerja la membrana de PVDF en solución salina tamponada con TRIS con Tween-20 durante 30 minutos en el agitador orbital a 45 revoluciones por minuto. Luego, hibride la membrana de PVDF con anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante diluida en tampón de bloqueo, durante 1 hora a temperatura ambiente en el mezclador de suspensión a 30 revoluciones por minuto.

A continuación, lave la membrana de PVDF con solución salina tamponada con TRIS con Tween-20 tres veces. Después del lavado, remoje la membrana de PVDF en solución salina Tween-20 tamponada con TRIS durante 30 minutos en el mezclador de suspensión a 45 revoluciones por minuto. Luego, reemplace la solución salina Tween-20 tamponada con TRIS con solución salina tamponada con fosfato para preservar la membrana de PVDF a 4 grados Celsius durante un máximo de 12 horas.

A continuación, mezcle los reactivos de sustrato quimioluminiscente mejorados 1 y 2 en una proporción de 1:1. Luego, retire la membrana de PVDF de la solución salina tamponada con fosfato y seque brevemente con bolsillos de perforación para absorber el exceso de humedad.

Inmediatamente, agregue 400 microlitros del reactivo quimioluminiscente a la superficie de la membrana y espere de 3 a 5 minutos. Seque brevemente para drenar el exceso de reactivo quimioluminiscente, evitando que la membrana se seque por completo. Utilice un sistema de imágenes de luminiscencia para exponer la transferencia.