JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 2:36 min • July 8th, 2025
La luciferasa es una enzima que oxida su sustrato para formar un producto bioluminiscente.
Esta propiedad de la luciferasa es útil para diseñar un sistema reportero basado en nanoluciferasa en el que se utiliza la versión dividida de la enzima. En este sistema, los fragmentos más pequeños y más grandes poseen una alta afinidad de unión entre sí y pueden reconstituir la enzima funcional.
Para utilizar el sistema basado en nanoluciferasa para detectar la proteína diana, el dominio de unión al receptor de la glicoproteína de pico del SARS-CoV-2, comience con una placa de cultivo que contenga células adherentes. Estas células contienen un plásmido que codifica la proteína diana junto con una secuencia específica para el fragmento más pequeño de nanoluciferasa modificada.
Tras la expresión, las células cultivadas producen bioreporteros, proteínas diana recombinantes fusionadas con el fragmento más pequeño de la luciferasa. Trate las células con un tampón de lisis e incube bajo agitación. Los componentes del tampón lisan rápidamente las células, liberando el contenido celular, incluidos los bioreporteros, en el sobrenadante.
Transfiera el sobrenadante a una placa de ensayo multipocillos. Complemente cada pocillo con la solución que contiene los fragmentos grandes de nanoluciferasa dividida e incube.
Durante la incubación, el fragmento grande se une espontáneamente con la subunidad pequeña del bioreportero y alcanza una conformación funcional. Agregue una solución que contenga furimazina, el sustrato, y coloque la placa de ensayo en un luminómetro.
La enzima funcional oxida la furimazina, emitiendo una señal luminiscente brillante. La magnitud de la señal se correlaciona con la concentración de proteína diana.
Para evaluar la señal luminiscente del bioreportero utilizando un ensayo de luciferasa, primero, prepare los componentes de la reacción y use el sobrenadante como fuente del bioreportero.
Diluya el LgBiT y el sustrato a 1x antes de usarlo. Transfiera 50 microlitros del sobrenadante de cada pocillo o tubo a una placa de 96 pocillos y agregue 50 microlitros de 1x LgBiT a cada pocillo. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Abra el software del luminómetro. Agregue 50 microlitros de sustrato 1x a cada pocillo. Coloque la placa en el luminómetro y ejecute el software.