Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:11 min. • July 8th, 2025
Durante la infección por coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo, o SARS-CoV-2, el dominio de unión al receptor de la proteína de pico del virus, RBD, se une a la enzima convertidora de angiotensina 2 de la célula huésped, ACE2, lo que facilita la entrada de células virales. En respuesta, el sistema inmunológico produce anticuerpos que se unen al RBD viral y evitan la entrada celular, reduciendo la infectividad viral.
Para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2 dirigidos a RBD, tome una suspensión de bioreportero recombinante que comprende fragmentos de proteínas de pequeño tamaño, fusionados con el RBD de pico del SARS-CoV-2. Agregue anticuerpos estándar contra el SARS-CoV-2 dirigidos a RBD y perlas magnéticas de unión a anticuerpos.
Durante la incubación, la región del anticuerpo Fc se une a los dominios de unión a Fc de las perlas. Además, el bioreportero recombinante se une a los anticuerpos contra el SARS-CoV-2 dirigidos a RBD unidos a perlas.
Después de la incubación, centrifugar la mezcla. Retire el sobrenadante que contiene bioreportero no unido. Vuelva a suspender las cuentas unidas en el tampón. Transfiera a una placa de varios pocillos.
Agregue una solución que contenga fragmentos de proteínas de gran tamaño, que tengan una alta afinidad por fragmentos de proteínas de tamaño pequeño. Los fragmentos de proteínas grandes y pequeños se unen, formando una enzima luciferasa activa modificada.
Agregue furimazina, un sustrato de luciferasa. La luciferasa cataliza la oxidación de la furimazina, provocando la emisión de luz. Usando un luminómetro, mida la luminiscencia, indicativa de la presencia de anticuerpos neutralizantes.
Las altas intensidades de señal sugieren altas concentraciones de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 dirigidos a RBD.
Para realizar el ensayo de detección de anticuerpos HiBiT-RBD, prepare el bioreportero HiBiT-RBD y combine 50 microlitros del sobrenadante que contiene HiBiT-RBD con 1 microgramo del anticuerpo comercial SARS-CoV-2-RBD en un microtubo de 1,5 mililitros.
Agregue 20 microlitros de proteína de unión a inmunoglobulina, o proteína G, a la solución. Lleve el volumen total a 300 microlitros agregando PBS. Incube los tubos en un agitador o rotador de tubos durante 30 minutos, centrifugue a 12,000 x g durante 30 segundos, luego, deseche el sobrenadante y lave con PBS. Repita el proceso tres veces para eliminar el HiBiT-RBD libre.
Vuelva a suspender las células en 50 microlitros de PBS y transfiéralas a una placa de 96 pocillos. Añade 50 microlitros de 1x LgBiT, y espera 5 minutos. Luego, agregue 50 microlitros de 1x sustrato NanoLuc. Lea inmediatamente la señal de luminiscencia con un luminómetro.