JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:03 min • July 8th, 2025
La homeostasis de las proteínas celulares, o proteostasis, implica la regulación del plegamiento y la función de las proteínas, junto con la degradación de las proteínas mal plegadas. Durante el envejecimiento, la maquinaria de proteostasis disminuye, lo que hace que las proteínas mal plegadas se acumulen y se agreguen aún más, lo que resulta en una disfunción celular.
Para determinar la disminución de la proteostasis asociada a la edad, comience con Caenorhabditis elegans transgénico adulto sincronizado con el desarrollo.
Las células musculares de estos gusanos expresan proteínas con repeticiones de poliglutamina expandida anormalmente, o polyQ, fusionadas con una etiqueta fluorescente. Las proteínas PolyQ son propensas a plegarse mal y, por lo tanto, al acumularse, pueden formar agregados.
Transfiera los gusanos a un portaobjetos de microscopio que comprende una almohadilla de agarosa e inmovilice con un producto químico adecuado para la obtención de imágenes de células vivas. Usando un microscopio de fluorescencia, visualice los músculos de la pared del cuerpo de los gusanos durante un período de tiempo para determinar las señales de focos fluorescentes brillantes, correspondientes a los agregados fluorescentes polyQ.
En cuestión de días, debido a la disminución de la proteostasis relacionada con la edad, se produce una acumulación progresiva de agregados de poliQ, lo que conduce a un mayor número de focos fluorescentes. El aumento de los agregados de poliQ en las células musculares causa toxicidad y altera la función de las células musculares, lo que resulta en parálisis.
Bajo un microscopio, registre el número de gusanos vivos y paralizados que carecen de movimiento ante estímulos mecánicos. El aumento de la tasa de parálisis de los gusanos sugiere una disminución de la proteostasis asociada a la edad en el tejido muscular de los gusanos.
Para medir la disminución de la proteostasis en el tejido muscular, elija 20 animales y móntelos en un portaobjetos de microscopio con una almohadilla de agarosa al 3% y una gota de 5 microlitros de azida de sodio de 10 milimolares.
Después de inmovilizar todos los gusanos, obtenga imágenes de todos los cuerpos de los animales con una lente de aumento de 10x. Use un filtro FITC o YFP, y la misma exposición, para cada animal. Cuando termine, deseche las diapositivas.
Cuente el número de focos en los músculos de la pared del cuerpo de todo el animal. Los focos son señales más brillantes y puntuadas que se pueden diferenciar de la señal soluble más tenue en el fondo.
En los días de puntuación, mire las placas con los animales y registre el número de animales paralizados. Luego, retire los animales paralizados del plato.
Al finalizar el experimento, calcule la tasa de parálisis para cada condición y trace la progresión de la parálisis.