Ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado: un ensayo de proximidad basado en perlas para cribar moléculas pequeñas que inhiben las interacciones proteína-proteína

En los sistemas biológicos, la proximidad de una proteína a su socio específico es un determinante crucial para una interacción proteína-proteína exitosa. Con pequeñas moléculas inhibidoras presentes, estas proteínas no pueden acercarse unas a otras, interrumpiendo sus interacciones.

Para detectar moléculas inhibidoras que interrumpan las interacciones entre dos proteínas, una chaperona y una co-chaperona, tome una placa de pocillos múltiples que contenga varias moléculas pequeñas. Complemente los pozos con perlas donantes que tengan co-chaperonas adheridas a sus superficies. Estas perlas contienen fotosensibilizadores para el ensayo de quimioluminiscencia.

Agregue una suspensión de perlas aceptoras conjugadas a las secuencias peptídicas derivadas de chaperonas que se unen específicamente a la co-chaperona. Las perlas contienen un tinte a base de tioxeno y fluoróforos esenciales para la visualización.

En pocillos con moléculas no inhibidoras, las altas afinidades entre los péptidos de unión a chaperonas y las cochaperonas atraen las perlas aceptoras y donantes. Mientras que las perlas permanecen distantes cuando los inhibidores están presentes.

Usando un lector de quimioluminiscencia, estudie la interacción. Tras la iluminación a una longitud de onda específica, los fotosensibilizadores de perlas donantes emiten oxígenos singletes altamente reactivos.

Sin moléculas inhibidoras, las especies emitidas alcanzan perlas aceptoras cercanas a las proximidades y reaccionan con las moléculas de colorante, causando quimioluminiscencia. Esta energía activa los fluoróforos de las perlas aceptoras, provocando la emisión de luz.

Por el contrario, en los pocillos con moléculas inhibidoras, los oxígenos singletes sufren descomposición, lo que lleva a una ausencia de emisión de luz, lo que indica una inhibición exitosa de las interacciones proteína-proteína.

Agregue perlas de donante de glutatión a una concentración de 10 microgramos por mililitro en PBS. Agregue GST-FKBP51 a una concentración final de 10 microgramos por mililitro e incube la reacción durante 10 minutos a 25 grados Celsius en la oscuridad.

Realice diluciones seriadas del compuesto de prueba en DMSO. Agregue 0,25 microlitros de diluciones de compuestos de prueba por triplicado, en la esquina de cada pocillo de una placa de 384 pocillos.

Para el control negativo, agregue 0,25 microlitros de DMSO y para el control positivo, agregue 0,25 microlitros de péptido Hsp90 C-terminal en los pocillos.

Agregue 22,5 microlitros de la solución que contiene perlas de donante de glutatión con proteínas marcadas con GST a cada pocillo. Agite bien el plato con las manos e incube en la oscuridad a 25 grados centígrados durante 15 minutos.

Diluya las perlas aceptoras con el péptido Hsp90 C-terminal adjunto a una concentración de 100 microgramos por mililitro en PBS de 0,5x. Agregue 2,25 microlitros de perlas aceptoras diluidas a cada pocillo. Agite e incube el plato en la oscuridad durante 15 minutos como se demuestra.

Encienda el instrumento lector de placas, mida la señal de la placa y analice los datos como se describe en el manuscrito de texto.