JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:43 min • July 8th, 2025
Para comenzar, prepare diluciones en serie del virus del herpes simple, un virus infeccioso envuelto, en tampón.
Obtener una placa multipocillo que contenga una monocapa de cultivo de células epiteliales susceptibles a virus. Reemplace el volumen específico de medios con suspensiones virales diluidas, asegurando una cobertura uniforme de una sola capa. Permita que el virus se adsorba en la superficie celular.
Elimine cualquier virus no adsorbido. Cubra la monocapa celular con medios que contengan metilcelulosa, formando una capa semisólida.
Tras la incubación, la envoltura viral y la membrana celular se fusionan, liberando la nucleocápside viral que encierra el genoma bicatenario en el citoplasma. Además, el genoma viral se libera en el núcleo celular.
Utilizando la maquinaria celular del huésped y la proteína del virión, el genoma viral expresa proteínas virales tempranas inmediatas, que regulan la expresión de genes tempranos. Las proteínas virales tempranas median la replicación del ADN viral.
Luego, los genes virales tardíos expresan proteínas estructurales, que junto con el genoma viral se ensamblan para producir partículas de virión de progenie. Las células infectadas por el virus se lisan, liberando viriones.
La metilcelulosa restringe el movimiento del virus, lo que hace que los viriones solo infecten las células vecinas y la posterior lisis, creando agujeros en la monocapa.
Después de la incubación, retire la capa de metilcelulosa. Agregue una solución de violeta de cristal etanólico. El etanol fija las células e inactiva los virus, mientras que el violeta cristalino tiñe las células. Como resultado, aparecen zonas o placas lisadas claras en la monocapa de células púrpuras.
Cuente las placas en cada pocillo en cada dilución del virus para determinar el título o la concentración del virus infeccioso.
Retire el medio de cultivo celular de uno o dos pocillos con una pipeta. Con cuidado, agregue la muestra de virus diluida gota a gota a cada monocapa de células, gota a gota a través del costado de cada pocillo.
Repita el proceso para cada uno o dos pocillos hasta que toda la placa esté llena con las muestras de virus que se están colocando. Balancee suavemente todo el plato con la mano.
Luego, incube la placa a 37 grados centígrados durante 1 hora para permitir la adsorción del virus. Después de cada 10 minutos, retire la placa de la incubadora, vuelva a balancearla suavemente para propagar el virus de manera más uniforme en cada pocillo y luego vuelva a colocarla en la incubadora.
Para disminuir la posibilidad de contar inadvertidamente el inóculo no absorbido, retire la muestra de virus de los pocillos con una punta de pipeta de 1.000 microlitros y deseche la muestra en un vaso de precipitados de desechos.
Coloque 2,5 mililitros de una capa de metilcelulosa en la placa y vuelva a colocarla en la incubadora. Desinfecte el vaso de precipitados de desechos, generalmente con la adición de lejía, un yodóforo o un virucida similar, antes de sacarlo del gabinete de bioseguridad.
Después de la incubación de dos días, retire la capa de metilcelulosa de uno o dos pocillos a la vez, con una pipeta, y colóquela en un vaso de precipitados de desechos. Agregue aproximadamente 2 mililitros de violeta cristalina al 1% y etanol al 50% a cada pocillo. Incube la placa con todos los pocillos llenos de la mancha durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
En este punto, desinfecte el vaso de precipitados de desechos, como se demostró anteriormente. Lave los platos vigorosamente con agua del grifo, hasta que la escorrentía sea clara.
Asegúrese de que haya diferencias de aproximadamente 10 veces en el número de placas en cada serie de dilución.