JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 5:32 min • July 8th, 2025
Las células huésped infectadas por patógenos microbianos sufren apoptosis, muerte celular programada. Durante la apoptosis, las ADNasas degradan el ADN cromosómico en pequeños fragmentos, lo que lleva a la muerte celular.
Para detectar la apoptosis mediante el ensayo TUNEL, tome un portaobjetos de vidrio con una sección de tejido cutáneo desparafinado y rehidratado infectado con un patógeno fúngico.
Tratar el tejido con proteinasa-K para inactivar las ADNasas celulares, evitando que degraden potencialmente el ADN durante el análisis. Agregue peróxido de hidrógeno para enfriar la reacción y lave el portaobjetos para eliminar la proteinasa-K sin reaccionar.
Agregue un tampón que contenga trifosfatos de desoxiuridina marcados con digoxigenina o dUTP. Complételo con una desoxinucleotidiltransferasa terminal, una enzima TdT e incube. En las células apoptóticas, la enzima TdT cataliza la unión de dUTP marcados a los grupos 3'-hidroxilo expuestos del ADN fragmentado.
A continuación, agregue un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con un reportero de rodamina e incube en la oscuridad para facilitar la unión de anticuerpos a dUTP marcados con digoxigenina, impartiendo fluorescencia roja al obtener imágenes.
Trate las muestras de tejido con una contratinción nuclear fluorescente para visualizar los núcleos. Coloque un cubreobjetos sobre la sección de tejido y visualícelo bajo un microscopio de fluorescencia.
La fluorescencia azul ayuda a identificar los núcleos de todas las células en la sección de tejido, mientras que la presencia de fluorescencia roja en las células teñidas con rodamina indica fragmentación del ADN debido a la apoptosis.
Para comenzar este procedimiento, prepare portaobjetos de vidrio hidrófilo con tejido de muestra, como se describe en el protocolo de texto.
Para desparafinar las secciones de tejido, lave los portaobjetos tres veces con xileno, durante 5 minutos cada uno, en un frasco de coplina. A continuación, lave los portaobjetos con etanol al 100% dos veces durante 5 minutos cada uno. Después de esto, lave los portaobjetos con etanol al 95% y etanol al 70% durante 3 minutos cada uno, luego, lave los portaobjetos una vez con PBS durante 5 minutos.
Para preparar portaobjetos experimentales y de control negativo, pretrate el tejido agregando proteinasa K recién diluida directamente a los portaobjetos. Incube los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego lave los portaobjetos en PBS dos veces durante 2 minutos cada uno.
Para preparar portaobjetos de control positivo, pretrate el tejido con tampón DN y, a continuación, incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de esto, la ADNasa I disuelta en el tampón DN hasta una concentración final de 0,1 microgramos por mililitro. Agregue la solución de ADN preparada a los portaobjetos. Incube los portaobjetos durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego lave los lados con agua destilada en un frasco de coplin cinco veces, durante 3 minutos cada una.
Apagar la reacción en peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos en PBS dos veces durante dos minutos cada uno. Luego, agregue tampón de equilibrio al tejido en los portaobjetos. Incube durante 10 segundos a temperatura ambiente, luego, retire el exceso de líquido alrededor de la sección de tejido.
Diluya la enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal en el tampón de reacción, luego agréguela al tejido en los portaobjetos experimentales y de control positivo. Incubar en una cámara humidificada durante 1 hora a 37 grados centígrados.
Después de esto, coloque los portaobjetos en un frasco de coplin que contenga la concentración de trabajo de tampón de parada. Agite durante 15 segundos y luego incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, lave los portaobjetos con PBS tres veces durante 1 minuto cada uno y retire el exceso de líquido.
A continuación, agregue el conjugado anti-digoxigenina precalentado a temperatura ambiente directamente sobre el tejido. Incube los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara oscura humidificada.
Una vez completada la incubación, lave los portaobjetos con PBS cuatro veces durante dos minutos cada uno. Retire cualquier exceso de líquido. Luego, agregue medio de montaje a los lados. Agregue 15 microlitros de solución DAPI al medio de montaje en los portaobjetos. Cubra cada portaobjetos con un cubreobjetos y séllelos con esmalte de uñas. Deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad.
Con un microscopio fluorescente, observe los portaobjetos inmediatamente después de completar el proceso de tinción.
Tome fotos 400 veces a intervalos aleatorios a lo largo de cada sección de la piel. Cuente las células azules teñidas con DAPI para asegurarse de que al menos 100 células por sección de piel, por animal, sean visibles. A continuación, cuente el número de células positivas para TUNEL que aparecen como células individuales rojas con bordes de células claras.