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Técnicas biológicas
0 vistas • 2:54 min • July 8th, 2025
La caspasa-3 y la caspasa-7 son proteasas que reconocen la secuencia del tetrapéptido DEVD en las proteínas diana, escindiéndolas en el extremo C del residuo de ácido aspártico. Estos juegan un papel destacado en la cascada de apoptosis (muerte celular programada).
Para evaluar la actividad de la caspasa-3/7 en células apoptóticas, comience con un tubo que contenga un explante de piel de dedo de rana infectado con hongos inductores de apoptosis. Agregue un tampón adecuado al tubo y algunas perlas metálicas.
Use el batido de perlas para alterar las células de la piel y liberar el contenido celular, incluidas las proteínas caspasa-3/7. Centrifugar el tubo, peletizar los restos celulares y los orgánulos. Aspire el sobrenadante rico en proteínas del tubo y la pipeta en los pocillos de una placa de ensayo multipocillos.
Complemente los pocillos con el reactivo de caspasa luminogénica. Este reactivo consiste en un sustrato proluminiscente que contiene el péptido DEVD en una solución tamponada que contiene ATP, iones de magnesio y enzima luciferasa.
Mezclar el contenido del pozo e incubar. Durante la incubación, la caspasa-3/7 escinde el sustrato proluminiscente, liberando aminoluciferina, un sustrato para la luciferasa, en la solución.
En presencia de iones ATP y magnesio, la luciferasa oxida la aminoluciferina liberada, generando un producto bioluminiscente. La cantidad de luz producida durante la reacción es proporcional a la actividad de las caspasas.
Para extraer proteínas de una muestra congelada de dedo de rana, coloque la muestra en un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de 1,5 mililitros, que contiene 100 microlitros de tampón de muestra y dos perlas de acero inoxidable.
Utilice un batidor de cuentas a máxima velocidad para lisar las células. Después de esto, coloque el tubo en hielo durante 3 minutos, luego, centrifugue el tubo para recolectar el sobrenadante.
Para realizar el ensayo de caspasa 3/7 en una placa de 384 pocillos, agregue 10 microlitros de tampón de muestra en blanco y 10 microlitros de extracto de proteína por triplicado. A continuación, pipetee 10 microlitros del reactivo caspasa 3/7 disponible en el mercado en el extracto de proteína y en los pocillos en blanco. Luego, agite la placa suavemente durante 15 segundos para mezclar los dos reactivos.
Incubar a temperatura ambiente y oscurecer durante 30 minutos. Finalmente, use un lector de placas luminiscentes para medir la luminiscencia de la muestra.