Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 2:54 min. • July 8th, 2025
La caspasa-3 y la caspasa-7 son proteasas que reconocen la secuencia del tetrapéptido DEVD en las proteínas diana, escindiéndolas en el extremo C del residuo de ácido aspártico. Estos juegan un papel destacado en la cascada de apoptosis (muerte celular programada).
Para evaluar la actividad de la caspasa-3/7 en células apoptóticas, comience con un tubo que contenga un explante de piel de dedo de rana infectado con hongos inductores de apoptosis. Agregue un tampón adecuado al tubo y algunas perlas metálicas.
Use el batido de perlas para alterar las células de la piel y liberar el contenido celular, incluidas las proteínas caspasa-3/7. Centrifugar el tubo, peletizar los restos celulares y los orgánulos. Aspire el sobrenadante rico en proteínas del tubo y la pipeta en los pocillos de una placa de ensayo multipocillos.
Complemente los pocillos con el reactivo de caspasa luminogénica. Este reactivo consiste en un sustrato proluminiscente que contiene el péptido DEVD en una solución tamponada que contiene ATP, iones de magnesio y enzima luciferasa.
Mezclar el contenido del pozo e incubar. Durante la incubación, la caspasa-3/7 escinde el sustrato proluminiscente, liberando aminoluciferina
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