JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:48 min • July 8th, 2025
Los macrófagos son células inmunitarias especializadas que eliminan las células que sufren apoptosis, muerte celular programada por fagocitosis.
Para evaluar el engullimiento de células apoptóticas, comience con un portaobjetos de vidrio que contenga células embrionarias fijas de Drosophila, incluidos los cuerpos apoptóticos engullidos por hemocitos, macrófagos invertebrados.
Primero, trate las células con un reactivo de bloqueo que bloquee los sitios no específicos. Agregue anticuerpos primarios que se unan a los receptores de croquemort, marcadores fagocíticos de los hemocitos. Lave el exceso de anticuerpos.
Agregue anticuerpos secundarios marcados con fosfatasa alcalina que se unan a los anticuerpos primarios. Ahora, agregue una solución de sustrato cromogénico adecuada en el portaobjetos e incube. Durante la incubación, la fosfatasa alcalina reacciona con el sustrato cromogénico para producir gránulos teñidos de púrpura en los hemocitos.
A continuación, agregue una mezcla de reacción que comprenda desoxinucleotidiltransferasa terminal, enzima TdT y nucleótidos unidos a digoxigenina. TdT cataliza la unión de nucleótidos unidos a digoxigenina a los extremos 3' OH expuestos del ADN fragmentado en los cuerpos apoptóticos.
A continuación, agregue anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con el reportero de peroxidasa que se unen a los nucleótidos en el sitio del daño del ADN. Trate las células con una solución de sustrato cromogénico específica de peroxidasa e incube. La peroxidasa cataliza la oxidación del sustrato, generando precipitados coloreados y tiñendo de marrón los cuerpos apoptóticos.
Finalmente, visualice las células bajo un microscopio óptico. La copresencia de gránulos púrpuras y señales marrones de las células indica hemocitos que contienen cuerpos apoptóticos fagocitosados.
Para inmunoteñir las células con anticuerpos anti-Croquemort, primero, remoje en serie el portaobjetos en metanol, luego PBS suplementado con Triton X-100 al 0,2%, seguido de PBS solo. A continuación, bloquee la unión inespecífica con 20 microlitros de suero porcino entero al 5% en PBS + Triton X-100 al 0,2%, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Retire el exceso de solución bloqueante y etiquete las células con 20 microlitros de antisuero anti-Croquemort a 4 grados centígrados durante la noche.
A la mañana siguiente, lave el portaobjetos en PBS + Triton X-100 durante cinco incubaciones de 10 minutos. Después del último lavado, enjuague el portaobjetos en PBS durante 10 minutos. Luego, etiquete las celdas con 20 microlitros de IgG anti-rata marcada con fosfatasa alcalina a temperatura ambiente durante 1 hora.
Al final de la incubación, lave el portaobjetos cinco veces en PBS + Triton X-100 como se demuestra, seguido de un remojo de 10 minutos en solución tampón. Luego, etiquete las células con una solución de sustrato de fosfatasa y observe las células bajo un microscopio óptico.
Cuando aparezcan fuertes señales púrpuras en los gránulos de hemocitos, retire el exceso de sustrato y sumerja el portaobjetos en tampón suplementado con EDTA durante 5 a 10 minutos. Al final de la incubación, enjuague las células con dos lavados de PBS de 5 minutos y trátelas con tampón de equilibrio durante 10 minutos.
Después de retirar la solución, etiquete las células con 20 microlitros de solución terminal de desoxinucleotidiltransferasa a 37 grados Celsius durante 1 hora. Luego, retire la solución del portaobjetos y remoje las células en 0,5 mililitros de tampón de lavado en 17 mililitros de agua, durante 10 minutos. A continuación, enjuague las células con tres lavados PBS de 5 minutos y etiquételas con 20 microlitros de antidigoxigenina peroxidasa durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave las células cuatro veces en PBS, como se demostró, y sumerja el portaobjetos en sustrato de peroxidasa durante incrementos de 30 segundos hasta que las células apoptóticas se vuelvan marrones. Cuando se haya logrado una tinción óptima, sumerja el portaobjetos en agua para detener la reacción de peroxidasa.