El ensayo reportero de ovocitos individuales in vitro: una técnica para estudiar la regulación de la traducción del ARNm diana durante la maduración de ovocitos in vitro

Los ovocitos en la profase I de la meiosis son transcripcionalmente activos; producen ARNm y los almacenan en forma latente. Durante la maduración, a medida que el ovocito entra en metafase, los ARNm almacenados se traducen en proteínas.

Para estudiar la traducción del ARNm, comience con ovocitos de ratón detenidos en profase I suspendidos en una gota de medio. Coloque la pipeta de retención cerca de un solo ovocito para mantenerlo en posición.

Tome una pipeta de microinyección que contenga una mezcla indicadora. Esta mezcla contiene dos tipos distintos de ARNm, uno que codifica la proteína fluorescente amarilla o YFP, un reportero fusionado con la región 3'-no traducida del gen diana, y un ARNm poliadenilado que codifica la proteína fluorescente roja.

Inyecte la mezcla reportera en el ovocito. Incubar los ovocitos microinyectados en un medio de maduración suplementado con cilostamida, un inhibidor químico que mantiene la detención de la profase I.

El ovocito traduce el ARNm poliadenilado hasta que la intensidad de la fluorescencia roja alcanza una meseta, mientras que los niveles de ARNm que codifican YFP que carecen de una cola de poliadenilación permanecen como tales.

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