El ensayo reportero de ovocitos individuales in vitro: una técnica para estudiar la regulación de la traducción del ARNm diana durante la maduración de ovocitos in vitro

Los ovocitos en la profase I de la meiosis son transcripcionalmente activos; producen ARNm y los almacenan en forma latente. Durante la maduración, a medida que el ovocito entra en metafase, los ARNm almacenados se traducen en proteínas.

Para estudiar la traducción del ARNm, comience con ovocitos de ratón detenidos en profase I suspendidos en una gota de medio. Coloque la pipeta de retención cerca de un solo ovocito para mantenerlo en posición.

Tome una pipeta de microinyección que contenga una mezcla indicadora. Esta mezcla contiene dos tipos distintos de ARNm, uno que codifica la proteína fluorescente amarilla o YFP, un reportero fusionado con la región 3'-no traducida del gen diana, y un ARNm poliadenilado que codifica la proteína fluorescente roja.

Inyecte la mezcla reportera en el ovocito. Incubar los ovocitos microinyectados en un medio de maduración suplementado con cilostamida, un inhibidor químico que mantiene la detención de la profase I.

El ovocito traduce el ARNm poliadenilado hasta que la intensidad de la fluorescencia roja alcanza una meseta, mientras que los niveles de ARNm que codifican YFP que carecen de una cola de poliadenilación permanecen como tales.

Transfiera los ovocitos tratados a un medio de maduración sin cilostamida, lo que ayuda a reanudar la meiosis; y el ARNm diana se somete a traducción para producir la proteína diana fusionada con el reportero fluorescente amarillo.

Realice imágenes de lapso de tiempo para visualizar las señales de fluorescencia a intervalos regulares.

Los ovocitos inyectados muestran niveles constantes de fluorescencia roja, mientras que la fluorescencia amarilla aumenta con el tiempo, lo que indica la traducción y la acumulación gradual de las proteínas reporteras.

Para comenzar, abra con cuidado los folículos antrales haciendo un pequeño corte en la pared del folículo con una aguja de calibre 26. Aísle los AOC intactos con varias capas de células de cúmulos utilizando una pipeta de vidrio operada por la boca. Utilice una pipeta más pequeña y desnude mecánicamente los AOC mediante pipeteo repetido.

Aspirar los ovocitos denudados y colocarlos en una placa de Petri con medio de maduración suplementado con 1 micromolar de cilostamida. Coloca el plato en una incubadora durante dos horas, para que los ovocitos se recuperen del estrés inducido por su aislamiento de los folículos.

Coloque un tubo capilar de vidrio de borosilicato de 10 centímetros de largo y un extractor mecánico para preparar las agujas de inyección. Dobla la punta de la aguja en un ángulo de 45 grados utilizando un filamento calentado para una inyección óptima. Coloque gotas de 20 microlitros de medio básico de recolección de ovocitos en un plato de poliestireno y cubra las gotas con aceite mineral ligero.

Prepare un volumen mayor de mezcla reportera agregando 12,5 microgramos por microlitro de Ypet UTR y mCherry cada uno. Almacene alícuotas de estos a menos 80 grados centígrados. Al descongelar, centrifugar la alícuota durante dos minutos a 20.000 x g. A continuación, transferirla a un nuevo tubo de microcentrífuga.

Cargue la aguja de inyección con aproximadamente 0,5 microlitros de mezcla indicadora. Coloque la pipeta de sujeción y la aguja de inyección en los soportes y colóquelos en la gota del medio de recolección de ovocitos.

Abra la aguja de inyección golpeándola suavemente contra la pipeta de sujeción. Coloque los ovocitos en una gota del medio de recolección básico e inyecte de 5 a 10 picolitros de la mezcla reportera. Incube los ovocitos en el medio de maduración con 1 cilostamida micromolar durante 16 horas para permitir que la señal de mCherry se estabilice.

Para la microscopía de lapso de tiempo, prepare una placa de Petri con dos gotas de 20 microlitros de medio de maduración para cada reportero inyectado. Una gotita con 1 cilostamida micromolar para el control de los ovocitos detenidos en profase I y una gota sin cilostamida para los ovocitos en maduración. Cubra las gotas con aceite mineral ligero y colóquelas en la incubadora.

Después de la preincubación, retire los ovocitos inyectados de la incubadora y lávelos cuatro veces en medio de maduración sin cilostamida. Mantener algunos ovocitos en medio de maduración con 1 cinostamida micromolar como grupo control de ovocitos en profase I.

Transfiera los ovocitos inyectados a sus respectivas gotas en la placa de microscopio de lapso de tiempo previamente preparada. Agrupar los ovocitos con una pipeta de vidrio cerrada para evitar su movimiento durante el registro.

Coloque el plato bajo el microscopio equipado con un sistema de iluminación de diodos emisores de luz y una platina motorizada equipada con una cámara ambiental mantenida a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, utilizando los parámetros mencionados en el manuscrito del texto.

Ingrese la configuración adecuada para el experimento de lapso de tiempo haciendo clic en "Aplicaciones" y luego en "Adquisición multidimensional". Seleccione la primera pestaña "Principal" y seleccione "Lapso de tiempo", "Múltiples posiciones de escenario" y "Múltiples longitudes de onda".

Seleccione la pestaña "Guardar" para ingresar la ubicación donde se debe guardar el experimento. Luego, seleccione la pestaña "Lapso de tiempo" para ingresar el número de puntos de tiempo, la duración y el intervalo de tiempo. Seleccione la pestaña "Etapa". Active el campo claro y localice la posición de los ovocitos abriendo una nueva ventana y seleccionando "Adquirir", "Adquirir" y "Mostrar en vivo".

Una vez localizados los ovocitos, vuelva a la "Ventana de adquisición multidimensional" y pulse "+" para establecer la ubicación de los ovocitos. Seleccione la pestaña "Longitudes de onda" y establezca tres longitudes de onda diferentes para campo claro, YFP y mCherry. Ajuste la exposición para Ypet y mCherry. Luego, inicie el experimento de lapso de tiempo haciendo clic en "Adquirir".

Para el análisis de la traslación UTR de Ypet-3', realice dos mediciones de región para cada ovocito. El ovocito en sí recortando en "Región de elipse" y una pequeña región que rodea el ovocito que se usará para la resta de fondo haciendo clic en "Región rectangular". Exporte los datos de medición de la región a una hoja de cálculo haciendo clic en "Abrir registro" y luego en "Registrar datos".

Para cada ovocito individual y para todos los puntos de tiempo medidos, reste la medición de la región de fondo de la medición de la región del ovocito por separado para las longitudes de onda YFP y mCherry.