Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:01 min. • July 8th, 2025
La película lagrimal, el líquido protector que cubre el ojo, ayuda a lubricar y mantener las células epiteliales de la córnea ocular, CEC, en un estado saludable y metabólicamente activo. Una película lagrimal comprometida, como en la enfermedad del ojo seco, puede causar la evaporación de las lágrimas de los CEC, aumentando su susceptibilidad a las infecciones y al daño inflamatorio.
Las formulaciones de lágrimas artificiales estabilizan la película lagrimal y mejoran la retención de agua, evitando la deshidratación celular.
Para detectar los efectos citotóxicos de una formulación de lágrima artificial de prueba en CEC utilizando el ensayo alamarBlue, comience con un cultivo adherente de CEC de origen humano en medios adecuados. Deseche el papel.
Incubar el cultivo celular con una concentración específica de la formulación de lágrimas artificiales. La formulación de lágrimas forma una capa sobre las células. Dependiendo del efecto acumulativo de los ingredientes constituyentes, las células pueden experimentar una pérdida de actividad metabólica.
A continuación, agregue una solución de alamarBlue que contenga resazurin, un tinte soluble en agua, débilmente fluorescente, débilmente fluorescente y de color azul.
La resazurina se difunde en las células y se reduce irreversiblemente en las células metabólicamente activas principalmente por las reductasas mitocondriales, ya que acepta electrones de los donantes de electrones de los procesos metabólicos de la respiración, formando una resourfina de color rosa y altamente fluorescente, que se mueve libremente fuera de las células hacia la solución. Transfiera la solución que contiene resorufina a una placa nueva de varios pocillos.
Con un lector de placas de fluorescencia, mida la intensidad de la fluorescencia. Un valor de intensidad de fluorescencia bajo indica una baja actividad metabólica celular, lo que sugiere efectos indeseables de la formulación lagrimal sobre las CEC.
Retire los medios de cultivo de los pocillos y trate inmediatamente las células con 150 microlitros de una formulación de prueba o solución de control de medios. Luego, incube las células durante 30 minutos.
Retire la solución de prueba de las células y agregue 0,5 mililitros de solución de colorante metabólico al 10%. Incube las células durante otras cuatro horas.
Después de la incubación, retire 100 microlitros de solución de tinte de cada pocillo y transfiéralo a una placa de 96 pocillos. Utilice un lector de placas para medir la fluorescencia de cada pocillo, ajustando la excitación a 540 nanómetros y la emisión a 590 nanómetros.